重组沃氏菌天门冬酰胺酶药物组合物及其制备法和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体地说是一种能用于治疗癌症的重组沃氏菌天门冬酰胺酶的药物组合物及其制备法，主要组成为5,000I.U或10,000I.U.的重组沃氏菌天门冬酰胺酶，分别各自含40mg或80mg甘露醇；或者为5,000I.U.或10,000I.U.的重组沃氏菌天门冬酰胺酶，分别各自含24.3mg或48.6mg甘氨酸，pH?7.0；或5,000I.U./10,000I.U.重组沃氏菌天门冬酰胺酶，5mmol/L的L-半胱氨酸，20mmol/L的磷酸缓冲液，0.7%的氯化钠，将含沃氏菌的天门冬酰胺酶基因克隆到表达质粒中，然后转染到含DE3基因的大肠杆菌中，本发明专利技术的重组沃氏菌天门冬酰胺酶药物组合物在制备过程中避免了有毒性的IPTG的添加，同时实现高水平地表达，所用表达质粒的卡那霉素抗性基因也符合生物药物的制备要求。

【技术实现步骤摘要】
重组沃氏菌天门冬酰胺酶药物组合物及其制备法和应用本专利技术涉及生物医药领域，具体地说是ー种能用于治疗癌症的重组沃氏菌天门冬酰胺酶的药物组合物及其制备法。天门冬酰胺酶能选择性地抑制癌细胞生长，临床上主要用于治疗急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocytic leukemia)和恶性淋巴瘤等癌症疾病。目前临床上使用的产品大多数是大肠杆菌(E. coli)和欧文氏菌(Erwinia carotovora)的天门冬酰胺酶；2011年美国FDA也批准了另ー种欧氏菌(Erwinia chrysanthemi)的天门冬酰胺酶用于临床。另外，还可对大肠杆菌的天门冬酰胺酶用聚こニ醇(Polyethylene Glycol, PEG)进行修 饰为培门冬酶，以增加其稳定性，并降低其致过敏性。其代表产品为Oncaspar (EnzonPharmaceuticals Inc),国内由恒瑞医药仿制；以上产品均已使用于临床。其中大肠杆菌的天门冬酰胺酶和欧氏菌的天门冬酰胺酶已在临床使用了较长时间，暴露出一定的毒副作用，这些毒副作用大多与酶对底物的专ー性不佳有夫；而且长期使用后，ー些患者会产生抗体，有耐受性的问题；而聚こニ醇修饰的酶价格过于昂贵，同时其酶活性比未修饰前会有所降低，而且在免疫反应上与未修饰的大肠杆菌的天门冬酰胺酶有一定的交叉，这限制了该种药物在临床上的大面积使用。沃氏菌的天门冬酰胺酶作为ー种新型的天门冬酰胺酶，与已有临床产品无免疫交叉性，同时对底物天门冬酰胺的专ー性更佳，稳定性也较好，因而具有良好的癌症治疗价值。中国专利描述了ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，但表达水平、使用IPTG (对人有一定的肝毒性)作为表达诱导物和所用质粒的青霉素(特定人群有过敏反应)抗性尚不能完全满足作为ー种生物药物的制备要求，另外也没有直接阐明其抗癌活性。本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供多种重组沃氏菌天门冬酰胺酶药物组合物及其制备法和应用。为了实现上述目的，本专利技术设计ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶注射药物，包括天门冬酰胺酶和相关辅料甘露醇、甘氨酸；也可不添加辅料，药物组合物每支含量为5,0001. U.或10，0001. U.，主要组成为5，0001. U.的重组沃氏菌的天门冬酰胺酶，40mg甘露醇或10，0001. U.的重组沃氏菌的天门冬酰胺酶，80mg甘露醇；或5，0001. U.的重组沃氏菌的天门冬酰胺酶，24. 3mg的甘氨酸，pH为7. O或10，0001. U.重组沃氏菌的天门冬酰胺酶，48. 6mg 甘氨酸，pH 7. O。本专利技术还包括另ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶注射药物，其特征在于注射液体积为5ml每支，主要组成为主要组成为5，0001. U.或10,0001. U.的重组沃氏菌的天门冬酰胺酶，5mmol/L的L-半胱氨酸,20mmol/L的磷酸缓冲液,O. 7%的氯化钠。本专利技术还包括上述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.将含沃氏菌的天门冬酰胺酶基因克隆到表达质粒中(如PET30)，该表达质粒的特征为含有卡那霉素抗性基因；表达的启动子为T71ac或T7 ;沃氏菌的天门冬酰胺酶基因没有融合任何标签序列或其他外源性DNA序列；b.将步骤a的质粒转染到含DE3基因的大肠杆菌中，大肠杆菌可以是B型如BL21(DE3)或K21型如HMS174 (DE3)，利用卡那霉素的抗性，选择获得含有I中所述质粒的转基因大肠杆菌的单ー菌落，卡那霉素的浓度为30-50 μ g/ml ；C.步骤b的转基因大肠杆菌单菌落在含30 μ g/ml的LB培养基中37°C，震荡培养；再接种于表达培养基(蛋白胨12g/L ;酵母提取物24g/L ；KH2PO4O. 17mol/L ；K2HP040. 72mol/ L;甘油 4ml/L ;葡萄糖 O. 05% (w/v);乳糖 O. 2% (w/v);硫酸镁 2mmol/L ;30 μ g/ml 卡那霉素)中37°C培养16-18hr ;该表达培养基的特征在于含葡萄糖和乳糖的混合物，其比例为葡萄糖乳糖(重量比)=0. 2-0. 3 I，要获得高水平表达培养时间为16-18hr ；d.步骤c的菌体离心，破碎，将重组沃氏菌的天门冬酰胺酶从菌体中释放出，再用阴离子交換柱层析和疏水柱层析纯化得到重组沃氏菌天门冬酰胺酶；该产品在SDS-PAGE上呈分子量为35kDa的单一条带，HPLC测定的纯度在90%以上，比活2501. U. /mg以上；e.上述步骤d纯化后的重组沃氏菌天门冬酰胺酶，按a中所述比例加入甘露醇或甘氨酸，冷冻干燥，得到注射用重组沃氏菌天门冬酰胺酶。所述的用阴离子交換柱层析和疏水柱层析的ニ步柱层析方法包括以下步骤I)、用阴离子交換柱层析法吸附杂质蛋白，收集不被吸附的重组天门酰胺酶，并进行超滤浓缩；2)、经过上述分离步骤得到的重组天门冬酰胺酶再用疏水色谱层析进行精制。所述的药物组合物可以应用于抑制多种癌细胞生长的抗癌活性，治疗相关的癌症疾病。本专利技术提供了ー种具有明确抗癌活性的重组沃氏菌天门冬酰胺酶药物组合物；在制备过程中避免了有毒性的IPTG的添加，同时实现高水平地表达，所用表达质粒的卡那霉素抗性基因也符合生物药物的制备要求。图I为纯化后重组沃氏菌天门冬酰胺酶HPLC图谱；图2为本专利技术的含沃氏菌天门冬酰胺酶DNA的表达载体；图3为重组沃氏菌天门冬酰胺酶对小鼠和人白血病癌细胞的抑制増殖作用曲线；图4为重组沃氏菌天门冬酰胺酶对不同癌细胞的抑制増殖作用所測定的IC5tl值；结合附图对本专利技术做进ー步说明，本专利技术所用装置的结构和对本专业的人来说是非常清楚的。本专利技术的装置和结构包括但不限于下述实施例。实施例一重组沃氏菌天门冬酰胺酶的表达含有Ikb的沃氏菌天门冬酰胺酶DNA片段的质粒(pJET/WAP)，用Nde I和Sal I消化(37°C，lhr)，切取Ikb的DNA片段，用DNA琼脂糖回收试剂盒提纯目的DNA片段。该提纯后的DNA片段插入到表达质粒pET30a的相应的Nde I和Sal I之间，用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。涂布在含30 μ g/ml的卡那霉素的LB+Agar培养基上；37°C培养12hr，直至有单菌落出现，挑取转化子，在含有30 μ g/ml的卡那霉素的LB培养基中37°C培养4hr ;再在3L表达培养基(蛋白胨12g/L ;酵母提取物24g/L ；KH2PO4O. 17mol/L ；K2HPO4 O. 72mol/L;甘油 4ml/L ;葡萄糖 O. 05%(w/v);乳糖 O. 2%(w/v)；硫酸镁2mmol/L ；30 μ g/ml卡那霉素)中扩大培养16_18hr。在4°C下,6，OOOg离心20min,弃上清，沉淀重新悬浮 于 Tris-NaCl 缓冲液中(50mM Tris, pH 7. 5，IOOmM NaCl, ImM DTT, ImMEDTA的缓冲液)。实施例ニ重组沃氏菌天门冬酰胺酶的提纯取上述例三所述的菌体混悬液，用超声波细胞破碎仪破碎，再次离心，取上清液上样于装填有I. 2L的DEAE琼脂糖凝胶树脂的层析柱上，用50mM Tris, pH 7. 5,50mM NaCl的缓冲液洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范铭琦，
申请(专利权)人：范铭琦，
类型：发明
国别省市：