一种高纯度纳豆激酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及食品工程中有关采用液体纯种发酵生物技术领域，具体的说是一种高纯度纳豆激酶的制备法，采用细菌划线或涂布分离出单一的纳豆枯草杆菌(Bacillus?subtilis?natto)，并在固体和液体培养基上进行纯种培养，采用液体深层发酵技术进行纳豆枯草杆菌的发酵，发酵产物通过离心或过滤的方法去除菌体，获得澄清的含纳豆激酶的培养液，上述培养液经过柱层析的方法去除其他杂质，纳豆激酶从层析柱上洗脱，再经浓缩、干燥得到产品，本发明专利技术同现有技术相比，去除了食品纳豆中含的嘌呤和维生素K2；采用细菌纯种培养、液体深层发酵，柱层析法得到了更高纯度的纳豆激酶。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品工程中有关采用液体纯种发酵生物
，具体的说是一种高纯度纳豆激酶的制备法。纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌产生的蛋白酶。最早从日本的传统食品纳豆中鉴别发现。经研究发现纳豆激酶具有降解血栓的功能，而且口服有效，长期使用能降低中风、 血管梗塞的风险，可作为一种功能性的保健食品，在世界各地均有销售。传统的纳豆激酶制备方法是制备纳豆后直接干燥粉碎，灌入胶囊后获得。但由于其含大豆成分如嘌呤和维生素K2，嘌呤长期服用可引起痛风，维生素K2有凝血作用，与纳豆激酶的溶血栓功能相反。本专利描述了一种采用细菌纯种培养、液体深层发酵，再用柱层析法精制以制备高纯度纳豆激酶的方法。国内申请02116667. 6中描述了一种利用枯草芽孢杆菌制备纳豆激酶的方法，其采用了枯草芽孢杆菌，而枯草芽孢杆菌包括了大量种类；不同的菌种其制备方法、培养特征也不同，但是在该申请中无法概括出明确的对于不同菌种的制备方法，该申请中所用的高浓度乙醇和硫酸铵沉淀纳豆激酶和使用干燥粉碎的方法，无法很好的保留纳豆激酶的天然活性，收率低，并且分离过程中的有机溶剂和高浓度硫酸铵对环境污染和人体具有危害。另外，该申请所述的目的产物纯度不明，虽然描述产物分子量为27730道尔顿，但没有表述蛋白质序列，同时没有直接描述其对纤维蛋白(血栓形成的主要物质之一)的纤溶活性；其中所述的目的产物的Pl值为8. 6，但是常规的纳豆激酶蛋白质序列计算的pi值为6. 3，先前专利中没有说明该原因，综上所述，该申请所制备的产物是否为纳豆激酶是不清晰的。国内申请200610168056是采用转基因技术制备异源性的重组纳豆激酶，所产生的纳豆激酶为包涵体，须用其他转基因手段得到可溶性蛋白，生产工艺复杂，最终产物为转基因产品，是否能直接用于人体还不清楚；同时该专利也描述了使用大量硫酸铵的蛋白质沉淀法，这会降低收率并对纳豆激酶的活性产生不利影响。本专利技术的目的是去除现有市场上粗制纳豆激酶产品中含有的，从纳豆中带入的嘌呤和维生素K2等杂质，能更好地实现纳豆激酶本身对心血管疾病的保护作用。为实现上述目的设计一种高纯度纳豆激酶的制备法，其特征在于由以下工艺步骤组成a、采用细菌划线或涂布分离出单一的纳豆枯草杆菌，并在固体和液体培养基上进行纯种培养，所述的固体培养基质量浓度为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖3. 5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，pH 7. 0 ;所述的液体培养基质量浓度为大豆蛋白胨10g/L、葡萄糖 10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠2g/L，pH 7. 0，培养温度为35-42。。，b、采用液体深层发酵技术进行纳豆枯草杆菌的发酵，发酵温度为38 42V ;发酵时间为30-72hr，并通过震荡、搅拌或通气的方法供氧，C、发酵后通过离心或过滤的方法去除菌体，获得澄清的含纳豆激酶的培养液，d、上述培养液经过柱层析的方法去除其他杂质，纳豆激酶从层析柱上洗脱，再经浓缩、干燥，然后用聚丙烯酰胺凝胶检测，产物呈一 28kDa的条带，用纤维平板检测可见清晰的纤维溶解圈。 步骤(a)纳豆枯草杆菌培养温度最优为37 °C。步骤(b)纳豆枯草杆菌发酵温度最优为42 °C。纳豆枯草杆菌发酵时间最优为48hr或5Ihr。柱层析方法为疏水层析或离子交换层析或先疏水层析再离子交换层析。所述的疏水层析采用疏水性树脂。所述的疏水性树脂是Phenyl琼脂糖凝胶或Butyl琼脂糖凝胶。所述的离子交换层析采用阳离子交换树脂。所述的阳离子交换树脂为CM琼脂糖凝胶或SP琼脂糖凝胶。所述的洗脱采用氯化钠溶液梯度洗脱。本专利技术同现有技术相比具有以下优点(I)菌种的选择及分离方法更好；菌种单纯，安全性更好，所分离得到的纳豆枯草杆菌(又名枯草纳豆杆菌(Bacillus subtilis natto)是从食品纳豆或用于制备纳豆的微生物中纯化而来，是纳豆枯草芽孢杆菌，对人体无害；(2)培养方法不同，选择了更合适的温度和配方，在42度时，能够得到更多的纳豆激酶。(3)纯化工艺更有效更安全，用疏水性树脂直接吸附纳豆激酶，能最大程度上保留纳豆激酶的天然活性，收率高，并避免了有机溶剂和高浓度硫酸铵对环境污染和对人体的危害。(4)本专利技术所描述的纳豆激酶是由纳豆枯草杆菌所生成的天然产物，不是转基因产物,生物安全性更好。图I纳豆枯草杆菌在固体培养基上的生长情况；图2是用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纳豆激酶的蛋白质条带；图3是纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性实验；图4是纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性实验；枯草纳豆杆菌的纯种培养和液体发酵法生产纳豆杆菌取纳豆制品或纳豆菌产品用5ml无菌水混悬后涂布(或划线)于固体培养基上， 在37°C培养12-16小时，直至有白色菌落长出(见图I)。培养特征为菌落呈圆至椭圆型， 白到乳白色，直径为2. 5_左右，表面略显干燥，菌落边缘清晰，菌落有一定粘性，在液体培养时粘性更大。能利用淀粉和葡萄糖。再挑取单菌落至5ml液体培养基中，在37°C旋转震荡(220rpm)培养6h ;再将上述培养物扩大培养至200ml液体培养基中，同样条件培养42小时。得到的纳豆激酶氨基酸序列表参见附表。纳豆激酶的纯化将所述的培养物在4，OOOg离心20分钟，收集澄清上层液体；也可用1_0. 45 μ m的微孔滤膜过滤除去菌体，获得澄清培养液。该液体中加入硫酸铵直至lmol/L的浓度，再次离心或过滤以去除不溶性的杂质。处理后的溶液通入50ml的疏水性的蛋白质分离填料 (如Phenyl或Butyl琼脂糖凝胶)。用250ml的lmol/L硫酸铵溶液清洗,去除嘌呤和维生素K2等杂质，最后用IOOml水洗脱纳豆激酶。也可再用离子交换填料(如CM-Sepharose) 在pH6. O的Tris-HCl的缓冲液中吸附上述分离所得纳豆激酶，用O lmol/L范围内NaCl 梯度洗脱纳豆激酶。再经浓缩和干燥获得纳豆激酶成品。经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，主蛋白呈单一的28kDa的蛋白质条带，见图2(自左向右的样品为蛋白质标准(由上向下依次为97· 4kDa、66. 2kDa、43kDa、31kDa、20kDa)，纳豆枯草杆菌发酵原液，分离出的杂质蛋白，纯化后的纳豆激酶(28kDa)。纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性的测定取纤维蛋白原51. 2mg加入16ml O. lmol/L的磷酸纳缓冲液pH 7. 4，混匀。再加入20ml O. 25%的琼脂糖以及12. 5U的凝血酶，所有成分混合均匀，缓慢倒入无菌平皿中， 带凝固待用。取10 μ I样品穿刺加入上述平皿中，37°C培养16小时，纳豆激酶可形成透明的纤维溶解圆圈，见附图3、图4。(图3左侧的是I μ g的纳豆激酶对纤维蛋白的溶解圈，右侧是O. 5 μ g的。图4左侧的是2 μ g的纳豆激酶对纤维蛋白的溶解圈，右侧的是I μ g，图 3，图4下方的是Oyg的溶解圈)。权利要求1.一种高纯度纳豆激酶的制备法，其特征在于由以下工艺步骤组成a、采用细菌划线或涂布分离出单一的纳豆枯草杆菌，并在固体和液体培养基上进行纯种培养，所述的固体培养基质量浓度为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖3. 5g/L、氯化钠 10g/L、琼脂15g/L，pH 7. O ;所述的液体培养基质量浓度为大豆蛋白胨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范铭琦，
申请(专利权)人：范铭琦，
类型：发明
国别省市：