本发明专利技术公开了一种ＩｇＧ型类风湿因子酶免疫检测方法，包括如下步骤：（１）试剂及标本准备；（２）在包被板微孔中加入ＩｇＧ－ＲＦ标准品、标本和质控品；（３）在一定温度下作用，然后将各孔液体弃净，洗涤，拍干；（４）各孔加入酶标记物；（５）重复步骤（３）；（６）各孔加入底物；（７）各孔加入终止液，震荡混匀；（８）用酶标仪读取吸光值Ａ；（９）计算；其中，步骤（２）中的包被板微孔为ＩｇＧ－Ｆｃ片段包板；步骤（４）中的酶标记物为抗ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ１）２片段抗体。本发明专利技术的ＩｇＧ型类风湿因子酶免疫检测方法，消除了交叉反应的影响，结果的准确性大大提高，经临床应用和验证获得了良好的结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种类风湿因子分型酶免疫检测方法，主要涉及一种IgG型类风湿因 子酶免疫检测方法。
技术介绍
类风湿因子(rheumatoid factor，简称RF)是一种抗IgG抗体，能与抗原决定簇即 IgG-Fc片段上某些区间起反应，故亦称抗IgG-Fc片段抗体。类风湿因子按Ig 型别共有五种，即 IgM-RF、IgG-RF, IgA-RF, IgD-RF, IgE-RF。作 为自身抗体的类风湿因子，尤其是IgM-RF、IgG-RF可与抗原IgG在体内特异性结合形成抗 原抗体复合物---免疫复合物(简称IC)，如未能被机体及时清除，即在体内血循环中形成 循环免疫复合物(简称CIC)，一定条件下易沉积在关节滑膜、浅表及其它器官组织的血管 壁上，一旦激活补体可引发IC介导的超敏炎症反应，使局部出现充血水肿、坏死和中性粒 细胞浸润为特征的炎症性反应和组织损伤。如发生在关节滑膜处，可造成滑膜炎，如未能控 制会逐渐累及关节囊、软骨直至骨的破坏，使关节损伤，表现为类风湿关节炎。与其它免疫球蛋白Ig类别的RF不同，IgG-RF因具有自身聚合形成免疫复合物的 特点而在类风关的发病机理中起重要作用，50%以上的类风关患者可检出IgG-RF，类风关 患者并发血管炎、肺纤维样病变及类风湿结节与IgG-RF有明显相关性，高水平的IgG-RF可 能表明予后不良。现国内绝大多数采用的类风湿因子凝集试验，其测得的主要是IgM-RF，因IgM是 五聚体，可与抗原载体胶元形成凝集颗粒而能够判定结果。但IgG-RF因IgG是单体分子， 无法采用凝集试验检测，同时也因抗原和被测IgG-RF均为IgG而使一般检测技术无法区别 抗原和IgG-RF，故IgG-RF通常采用酶免疫技术(简称ELISA)，以与正常人IgG有种系差异 的兔IgG或将人IgG加热使其变性导致异质性的人变性IgG作为包被抗原，再以酶标记的 抗人IgG作为第二抗体来检测IgG-RF。此法旨在将作为抗原的IgG对需检测的IgG-RF干 扰排除，但实际依然存在交叉反应影响而结果准确性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案来实现(1)试剂及标本准备(2)在包被板微孔中分别加入八点IgG-RF标准品(0、40、80、160、320、640、1280、 2560IU/ml)、稀释好的标本和质控品各50 150 μ 1，放置35 39°C水浴箱中孵育1 3 小时；(3)将各孔液体弃净，用洗涤液洗涤，拍干；(4)各孔加入50 150 μ 1酶标记物。放置35 39°C水浴箱中，孵育0. 5 2小 时；3(5)重复步骤(3)；(6)各孔加入50 150 μ 1预先稀释好的底物，放置35 39°C水浴箱中孵育10 30分钟；(7)各孔加入25 100 μ 1终止液，震荡混勻；(8)用酶标仪在490nm波长用0标准管校零读取吸光值A ； (9)计算以IgG-RF浓度为横坐标，相对应的吸光值A为纵坐标，在半对数纸上画 出标准曲线，然后根据标本的吸光值A在标准曲线上求IgG-RF含量；其中，步骤(2)中的包被板微孔为IgG-Fc片段包板。在所述步骤(1)中的试剂及标本具体为①稀释液0. 01M, PH7. 2磷酸盐缓冲液。由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入牛血清白蛋白0. 3克即成。②洗涤液0. 01M, PH7. 2磷酸盐氯化钠缓冲液由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入氯化钠0. 85克即成。③显色剂临用前按以下比例配置底物邻苯二胺(简称0PD)原液5毫升；PH5. 0底物缓冲液10毫升0. 066M磷酸氢二钠溶液等量加入0. 033M柠檬酸溶液；3 ^H2O2 70 毫升。④终止液2M H2SO4溶液。⑤血清标本用稀释液作1 100稀释。IgG-Fc片段由上海德波生物技术有限公司提供，即由人IgG用胃蛋白酶水解，再 以DEAE纤维素层析柱和S印hadeXG200柱层析提取并纯化而成，以1 500稀释的IgG-Fc 片段包板，用牛血清白蛋白(简称BSA)封闭。步骤⑷中的酶标记物为抗IgG-F(^ib1)2片段抗体。酶标记物，即酶标抗体(即二抗)，选用抗IgG-F(^1)2片段抗体，可以按Nakene 法，采用Sigma公司产HRP (PZ3. 0)标记同样由Sigma公司提供的抗人IgG Fab片段抗体而 成，使用效价为1 3800。按Nakane法。步骤(2)中的IgG-RF标准品采用丹麦哥本哈根生物学标准实验室产品，IgG-RF含 量为 1. 54X 106IU/ml。本专利技术与现有技术的主要区别在于1、采用人IgG经胃蛋白酶切断后得到的Fc片段作为包被抗原。人体发现的抗IgG抗体实际有很多种，这些抗体因针对IgG分子的不同区域(抗 原决定簇)而不同，只有作用于IgG-Fc片段(CH2、CH3)上的抗体是类风湿因子。2、选用抗IgG-F(^ib1)2片段抗体作为酶标抗体。为了避免酶标抗体(二抗)在与IgG_RF(结合在包被抗原Fc片段上)结合的同 时又与包被抗原IgG-Fc片段发生作用，专利技术人将酶标抗体(二抗)由抗IgG抗体改为抗 IgG-F(Bb1)2片段抗体，这样酶标抗体(二抗)只与结合在包被抗原上IgG-RF的F(ab%片 段作用，不与包被抗原Fc片段结合，形成IgG-Fc片段-IgG-RF-抗IgG-F (ab1) 2抗体的免疫复合物，完全避免了由交叉反应导致的结果不准确。综上所述，专利技术人通过利用IgG分子结构、抗原抗体反应特异性的特点，即以 IgG-Fc片段作为IgG-RF的靶抗原，再以抗化6呼妯1)2片段抗体作为第二抗体，以此建立的 IgG-RF酶免疫检测方法，消除了交叉反应的影响，结果的准确性大大提高，经临床应用和验 证获得了良好的结果。附图说明图1为本专利技术的标准曲线图 具体实施例方式下面结合具体实施方式来进一步说明本专利技术。1材料和方法1. 1主要试剂包板IgG-Fc片段作为包被抗原即包被板微孔，IgG-Fc片段由上海德波生物技术 有限公司提供，即由人IgG用胃蛋白酶水解，再以DEAE纤维柱和S印hadeXG200提取并纯化 而成。以1 500稀释的IgG-Fc片段包板，牛血清白蛋白封闭。酶标抗体用抗IgG-F (ab1) 2片段抗体，按Nakene法，采用Sigma公司产HRP (PZ3. 0) 标记同样由Sigma公司提供的抗IgG-F(abl)2片段抗体而成。使用效价为1 3800。IgG-RF标准品采用丹麦哥本哈根生物学标准实验室产品，IgG-RF含量为 1. 54X 106IU/ml。磷酸盐缓冲液(PBS)、标本稀释液。OPD (酶促反应底物)、OPD缓冲液、终止液。2操作步骤(1)试剂及标本准备①稀释液0. 01M、PH7. 2磷酸盐缓冲液。由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入牛血清白蛋白0. 3克即成。②洗涤液0. 01M, PH7. 2磷酸盐氯化钠缓冲液由0. OlM磷酸氢二钠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＩｇＧ型类风湿因子酶免疫检测方法，包括如下步骤：（１）试剂及标本准备；（２）在包被板微孔中分别加入八点ＩｇＧ－ＲＦ标准品（０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、２５６０ＩＵ／ｍｌ）、稀释好的标本和质控品各５０～１５０μｌ，放置３５～３９℃水浴箱中孵育１～３小时；（３）将各孔液体弃净，用洗涤液洗涤，拍干；（４）各孔加入５０～１５０μｌ酶标记物，放置３５～３９℃水浴箱中，孵育０．５～２小时；（５）重复步骤（３）；（６）各孔加入５０～１５０μｌ预先稀释好的底物，放置３５～３９℃水浴箱中孵育１０～３０分钟；（７）各孔加入２５～１００μｌ终止液，震荡混匀；（８）用酶标仪在４９０ｎｍ波长用０标准管校零读取吸光值Ａ；（９）计算：以ＩｇＧ－ＲＦ浓度为横坐标，相对应的吸光值Ａ为纵坐标，在半对数纸上画出标准曲线，然后根据标本的吸光值Ａ在标准曲线上求ＩｇＧ－ＲＦ含量，其特征在于：步骤（２）中的包被板微孔为ＩｇＧ－Ｆｃ片段包板；步骤（４）中的酶标记物为抗ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ↑［１］）↓［２］片段抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许荣，钟丽民，周丽萍，
申请(专利权)人：上海市长宁区光华中西医结合医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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