腺病毒肿瘤诊断法制造技术

本文提供了使用重组腺病毒检测受试者中癌症的组合物和方法。更具体地，使用重组腺病毒诊断患者的癌症以及进一步使用重组腺病毒筛选有效治疗所述患者癌症的化合物。

Adenovirus tumor diagnosis

The composition and method for detection of cancer in subjects using recombinant adenovirus are provided. More specifically, the use of recombinant adenovirus to diagnose cancer in patients and to further use recombinant adenovirus to screen effective compounds for the treatment of cancer patients.

【技术实现步骤摘要】
腺病毒肿瘤诊断法本申请为申请日为2013年3月14日、申请号为201380014047.7、专利技术名称为“腺病毒肿瘤诊断法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2012年3月14日提交的美国临时申请No.61/610,970的优先权，所述临时申请为了所有目的全文纳入本文。对联邦政府资助研发做出的专利技术的权利的声明本专利技术是在美国国家卫生研究院授予的政府支持的基金R01HG004876、R21RR024453和R43RR031424下进行的。政府对本专利技术拥有某些权利。
技术介绍
细胞从实体瘤扩散到身体远端的被称为转移的过程造成了所有肿瘤相关的死亡的90％以上。起源于原发性肿瘤的细胞可进入循环系统并流动以侵入远离原发性肿瘤的器官和组织并在其中定殖和增殖。因此，这些循环肿瘤细胞(CLC)的检测为转移性癌细胞的早期鉴定和治疗靶向提供了宝贵的机会(Cristofanilli,2004；deBono,2008)。目前用于检测CTC的技术包括反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、流式细胞术、荧光原位杂交以及最近的微流体技术。遗憾的是，RT-PCR不能区分活的转移性CTC和源于原发性肿瘤的核酸或细胞片段。基于抗体的技术不能用于检测所有癌症，而仅能检测那些表达最常见的和被很好地表征的标记物的癌症。当前系统的CTC计数(enumeration)仅提供了一层关于癌症诊断的信息。已经证明(Veridex,RaridanNJ)装置取得了CTC分析的商业成功并且其被FDA批准用于乳腺、前列腺和结肠，然而在卵巢、直肠和肺中的使用还有待批准。所述系统的局限性包括：(a)依赖于EpCAM的表达水平(PunnooseEA,等人,PLoSONE.2010；5(9):e12517)，(b)不使用间充质标记物(PunnooseEA,等人,PLoSONE.2010；5(9):e12517)，(c)依赖于抗体亲和力用来捕获(NagrathS,等人，Nature,2007；450(7173):1235-9.18097410)，以及最重要的(d)缺少CTC表型特征。没有任何抗体具有100％的肿瘤或组织特异性，而且抗体既结合活的CTC也可以结合死的CTC。因此需要更敏感的、更加特异的以及可应用更加广泛的检测血液中非常少量的CTC的技术。另外，急需开发新的诊断剂和工具，其不仅能检测和捕获CTC还能对它们的恶性潜能进行定量以及“预先”确定在切除个体患者的肿瘤中最有效疗法。尽管癌症在基因组范围内具有复杂性和可变性，但是共同点是它们都具有生长失调的表型，即所谓的癌症标志，这是由相对少量的关键途径发生突变而引起的。申请人没有将重心放在检测大量的且在肿瘤之间高度可变的单个基因损伤上，而是构建了诊断性病毒，所述病毒在其基因组中整合了多个转录和分子模块以感染和检测患者的肿瘤，报告肿瘤的分子“标志”以及“预先”报告肿瘤对不同疗法的反应。使用这些试剂，任何给定肿瘤的分子损伤和恶性特征可被快速识别(24小时以内)并可通过标准化自动平台来评分。另外，这些试剂也能作为报告分子以快速且直接地测定患者的肿瘤是否可能对具体治疗产生反应。
技术实现思路
在一方面，提供了检测受试者中癌症的方法。所述方法包括给予受试者重组报告性腺病毒。使所述重组报告性腺病毒感染受试者中的癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞。从受试者中获得含有所述报告病毒感染的癌细胞的样品并检测所述报告病毒感染的癌细胞，从而检测了所述受试者中的癌症。在另一方面，提供了检测受试者中癌症的方法。所述方法包括从受试者中获得含有癌细胞的样品。使重组报告性腺病毒与所述癌细胞接触。使所述重组报告性腺病毒感染所述癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞，检测所述报告病毒感染的癌细胞从而检测了所述受试者中的癌症。在另一方面，提供了确定测试化合物是否抑制了来自癌症患者的癌细胞的生长的方法。所述方法包括从受试者中获得含有癌细胞的样品。将重组报告性腺病毒与所述癌细胞接触。使所述重组报告性腺病毒感染所述癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞。使所述报告病毒感染的癌细胞生长足够的时间。测定所述报告病毒感染的癌细胞的生长水平并将所述水平与对照水平对比，其中与对照水平相比的低水平表明所述测试化合物抑制了来自所述患者的细胞癌的生长。在另一方面，提供了分离来自受试者的样品中报告病毒感染的癌细胞的方法。所述方法包括将所述报告病毒感染的癌细胞与未感染的细胞分离，其中所述分离至少部分地基于所述报告病毒感染的癌细胞的表达的报告基因表型。在另一方面，提供了含有癌细胞报告分子模块和癌细胞结合模块的重组报告性腺病毒。在另一方面，提供了检测受试者中癌症的方法。所述方法包括将本文(包括其中的实施方案)中提供的含有重组报告性腺病毒给予受试者。使所述重组报告性腺病毒感染所述受试者中的癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞。从含有所述报告病毒感染的癌细胞的受试者中获得样品，并检测所述报告病毒感染的癌细胞从而检测了所述受试者中的癌症。在另一方面，提供了检测受试者中癌症的方法。所述方法包括从受试者中获得含有癌细胞的样品。将本文(包括其中的实施方案)中提供的重组报告性腺病毒与所述癌细胞接触。使所述重组报告性腺病毒感染癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞，检测所述报告病毒感染的癌细胞从而检测了所述受试者中的癌症。在另一方面，提供了检测测试化合物是否抑制了来自癌症患者的癌细胞的生长的方法。所述方法包括从受试者中获得含有癌细胞的样品以及将本文(包括其中的实施方案)中提供的重组报告性腺病毒与所述癌细胞接触。使所述重组报告性腺病毒感染癌细胞从而形成报告病毒感染的癌细胞。使所述报告病毒感染的癌细胞生长足够的时间并测定所述报告病毒感染的癌细胞的生长水平。将所述水平与对照水平对比，其中与对照水平相比的低水平表明所述测试化合物抑制了来自所述患者的癌细胞的生长。在另一方面，提供了检测癌症的试剂盒。所述试剂盒包括本文(包括其中的实施方案)中提供的重组报告性腺病毒。在另一方面，提供了用于筛选癌症药物的试剂盒。所述试剂盒包括癌症抑制性化合物和本文(包括其中的实施方案)中提供的重组报告性腺病毒。在另一方面，提供了用于分离癌细胞的试剂盒。所述试剂盒包括用于检测表达的报告基因表型的装置和本文(包括其中的实施方案)中提供的重组报告性腺病毒。附图说明图1.癌症的标志图2.Adsemly在体外反应中快速地从模块部分装配Ad基因组。图2上部分：被分成转录和功能模块并被克隆到质粒上的基因组。图2中间部分：将E1、E3和E4模块用肿瘤特异性启动子驱动的荧光蛋白修饰以突出CTC。图2下部分：多位点特异性的病毒在体外重新装配和重建示意图。图3.p16被沉默时E2F-应答启动子被激活。图4.将空间滤波器(遮罩)放置在所述器件外观的放大图像中。染色细胞的输入荧光脉冲信号用不同的空间滤波器调节，然后将所述信号用PMT记录，产生了时间域上的不同的光电流波形，其对应于细胞通过微流体通道时的不同的位置，例如(111)、(1101)或(1011)。这种时空编码技术通过使用仅仅一个PMT来区分3种或甚至更多种信号，从而降低了系统的大小和成本。图5.图5(a)装置结构。将250μm宽的主流体通道分成3个亚通道。中间的通道用于收集废液，同时左边和右本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组报告性腺病毒，其包含第一癌细胞报告模块、第二癌细胞报告模块和癌细胞结合模块，其中所述第一癌细胞报告模块包含与第一报告基因可操作地连接的在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中有活性的启动子，以及所述第二癌细胞报告模块包含可操作地连接到第二报告基因的癌症应答启动子。

【技术特征摘要】
2012.03.14 US 61/610,9701.重组报告性腺病毒，其包含第一癌细胞报告模块、第二癌细胞报告模块和癌细胞结合模块，其中所述第一癌细胞报告模块包含与第一报告基因可操作地连接的在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中有活性的启动子，以及所述第二癌细胞报告模块包含可操作地连接到第二报告基因的癌症应答启动子。2.重组报告性腺病毒，其包含第一癌细胞报告模块、第二癌细胞报告模块和癌细胞结合模块，其中所述第一癌细胞报告模块包含与第一报告基因可操作地连接的在所有细胞中有活性的启动子，以及所述第二癌细胞报告模块包含可操作地连接到第二报告基因的癌症应答启动子。3.重组报告性腺病毒，其包含第一癌细胞报告模块、第二癌细胞报告模块和癌细胞结合模块，其中所述第一癌细胞报告模块包含与第一报告基因可操作地连接的组成型启动子，以及所述第二癌细胞报告模块包含可操作地连接到第二报告基因的癌症应答启动子。4.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述第一报告基因或所述第二报告基因包含荧光报告基因。5.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其进一步包含第三癌细胞报告模块，其中所述第三癌细胞报告模块包含与第三报告基因可操作地连接的癌症应答启动子。6.权利要求5的重组报告性腺病毒，其中所述第一癌细胞报告模块能够表达第一报告基因表型，所述第二癌细胞报告模块能够表达第二报告基因表型，并且所述第三癌细胞报告模块能够表达第三报告基因表型。7.权利要求6的重组报告性腺病毒，其中所述第一报告基因表型、所述第二报告基因表型和所述第三报告基因表型均为可检测地不同的。8.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述癌细胞结合模块包含结合CD46的腺病毒尾丝蛋白。9.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述癌细胞结合模块包括Ad3、Ad11或Ad34尾丝结。10.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述第一癌细胞报告模块的所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。11.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述癌症应答启动子仅在以下中有活性：(a)pRb/p16无活性细胞；(b)具有激活的EGFR/RAS/RAF/MAPK途径的细胞；或(c)具有有活性的转化生长因子(TGF)-β信号传导的细胞。12.权利要求11的重组报告性腺病毒，其中所述癌症应答启动子是E2F、血清应答元件(SRE)或SMAD-应答启动子。13.权利要求1-3中任一项的重组报告性腺病毒，其中所述报告基因编码融合蛋白，其包含荧光蛋白和指导所述融合蛋白定位于细胞质或细胞核的蛋白质。14.权利要求13的重组报告性腺病毒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·奥谢，C·帕沃斯，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：美国,US