一种新的DNA核酸切割酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新的DNA核酸切割酶及其应用，具体地，本发明专利技术涉及一种突变型的基因编辑蛋白和含有突变型的基因编辑蛋白的融合蛋白，本发明专利技术的突变型的基因编辑蛋白和融合蛋白可识别更多种类的PAM序列，从而扩展基因编辑的范围，还可提高编辑的效率且能够精确的介导目标位点的突变，并且能够在动植物细胞中广泛适用。

A new DNA nuclease and its application

【技术实现步骤摘要】
一种新的DNA核酸切割酶及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种新的DNA核酸切割酶及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas是一种来自细菌降解入侵病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。将该机制运用到动物和植物细胞中，针对靶DNA进行切割，DNA受损后，细胞会启动自身的修复机制，如同源重组(HR)、非同源末端链接(NHEJ)等修复机制，其在修复过程中会出现碱基的替换、缺失或插入等错误，以此实现基因功能的突变。目前，CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。CRISPR-Cas9系统发挥作用需要两个步骤：1、sgRNA与靶基因之间的碱基配对结合；2、Cas9识别靶基因中前间区序列邻近基序(PAM序列)，与sgRNA-DNA复合体结合完成DNA链的切割。PAM序列的识别限制了CRISPR-Cas9编辑的效率以及编辑的范围。SpCas9可切割的基因序列被限制在含有NGG(N代表任DNA中的任一种碱基，G代表鸟嘌呤)的位点，这就限制了对其他不含NGG序列的靶标位点进行编辑的可能性，降低了spCas9在基因编辑中的实用价值。最近，报道了两种spCas9的变体：一种是Xcas9，另一种是Cas9-NG。但是这两种变体在植物细胞中的表现与人体细胞中表现却不尽相同，文献报道xCas9在植物细胞中对靶基因的编辑效率相对较低，其在水稻中不能识别含有NG序列的靶基因。因此，本领域迫切需要寻找新的Cas9变体，使其能够识别更多种类的PAM序列，以期扩展基因编辑的范围、提高编辑的效率且能够精确的介导目标位点的突变，并且能够在动植物细胞中广泛适用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的Cas9变体，使其能够识别更多种类的PAM序列，以期扩展基因编辑的范围、提高编辑的效率且能够精确的介导目标位点的突变，并且能够在动植物细胞中广泛适用。本专利技术第一方面提供了一种突变型的基因编辑蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有基因编辑活性，并且所述突变蛋白在野生型的基因编辑蛋白的对应于SEQIDNO.:1的选自下组的核心氨基酸发生突变：第262位丙氨酸(A)；第324位精氨酸(R)；第409位丝氨酸(S)；第480位谷氨酸(E)；第543位谷氨酸(E)；第694位甲硫氨酸(M)；第1111位亮氨酸(L)；第1135位天冬氨酸(D)；第1218位甘氨酸(G)；第1219位谷氨酸(E)；第1332位丙氨酸(A)；第1335位精氨酸(R)；和第1337位苏氨酸(T)。在另一优选例中，所述第262位丙氨酸(A)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、或其组合，优选苏氨酸(T)。在另一优选例中，所述第324位精氨酸(R)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、或其组合，优选亮氨酸(L)。在另一优选例中，所述第409位丝氨酸(S)突变为异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、或其组合，优选异亮氨酸(I)。在另一优选例中，所述第480位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、或其组合，优选赖氨酸(K)。在另一优选例中，所述第543位谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、或其组合，优选天冬氨酸(D)。在另一优选例中，所述第694位甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、或其组合，优选异亮氨酸(I)。在另一优选例中，所述第1111位亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、或其组合，优选精氨酸(R)。在另一优选例中，所述第1135位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、或其组合，优选缬氨酸(V)。在另一优选例中，所述第1218位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、或其组合，优选精氨酸(R)。在另一优选例中，所述第1219位谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、或其组合，优选苯丙氨酸(F)。在另一优选例中，所述第1332位丙氨酸(A)突变为精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、或其组合，优选精氨酸(R)。在另一优选例中，所述第1335位精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、或其组合，优选缬氨酸(V)。在另一优选例中，所述第1337位苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、或其组合，优选精氨酸(R)。在另一优选例中，所述第262位丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)；第324位精氨酸(R)突变为亮氨酸(L)；第409位丝氨酸(S)突变为异亮氨酸(I)；第480位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)；第543位谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)；第694位甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)；第1111位亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)；第1135位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)；第1218位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)；第1219位谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)；第1332位丙氨酸(A)突变为精氨酸(R)；第1335位精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)；和第1337位苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)。在另一优选例中，所述的突变选自下组：A262T；R324L；S409I；E480K；E543D；M694I；L1111R；D1135V；G1218R；E1219F；A1332R；R1335V；和T1337R。在另一优选例中，所述突变型的基因编辑蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2或3所示。在另一优选例中，所述突变型的基因编辑蛋白除所述突变(如262、324、409、480、543、694、1111、1135、1218、1219、1332、1335和1337)外，其余的氨基酸序列与SEQIDNO.:1所示的序列相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有基因编辑活性。在另一优选例中，与SEQIDNO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变型的基因编辑蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有基因编辑活性，并且所述突变蛋白在野生型的基因编辑蛋白的对应于SEQ IDNO.:1的选自下组的核心氨基酸发生突变：/n第262位丙氨酸(A)；/n第324位精氨酸(R)；/n第409位丝氨酸(S)；/n第480位谷氨酸(E)；/n第543位谷氨酸(E)；/n第694位甲硫氨酸(M)；/n第1111位亮氨酸(L)；/n第1135位天冬氨酸(D)；/n第1218位甘氨酸(G)；/n第1219位谷氨酸(E)；/n第1332位丙氨酸(A)；/n第1335位精氨酸(R)；和/n第1337位苏氨酸(T)。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变型的基因编辑蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有基因编辑活性，并且所述突变蛋白在野生型的基因编辑蛋白的对应于SEQIDNO.:1的选自下组的核心氨基酸发生突变：
第262位丙氨酸(A)；
第324位精氨酸(R)；
第409位丝氨酸(S)；
第480位谷氨酸(E)；
第543位谷氨酸(E)；
第694位甲硫氨酸(M)；
第1111位亮氨酸(L)；
第1135位天冬氨酸(D)；
第1218位甘氨酸(G)；
第1219位谷氨酸(E)；
第1332位丙氨酸(A)；
第1335位精氨酸(R)；和
第1337位苏氨酸(T)。


2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如下式I或I’所示：
B-L-A(I)
A-L-B(I’)
式中，
A为权利要求1所述的突变型的基因编辑蛋白；
B为碱基编辑器元件；
L为无或连接肽；
各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。


3.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的突变型的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白。


4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。


6.一种产生权利要求1所述的突变型的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达突变型的基因编辑蛋白或融合蛋白；和/或
分离所述突变型的基因编辑蛋白或融合蛋白。


7.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂包含权利要求1所述突变型的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白。


8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的基因编辑试剂。


9.一种权利要求1所述的突变型的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于对植物进行基因编辑。


10.一种对植物进行基因编辑的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37