使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰制造技术

本文提供了用于改变细胞器的基因组的方法和系统。在一些实施方案中，该方法包括将重组DNA构建体引入细胞器中，该重组DNA构建体包含编码至少一个指导RNA的第一多核苷酸和编码多核苷酸指导的多肽的第二多核苷酸；以及在第一多核苷酸和第二多核苷酸均表达的条件下使包含细胞器的细胞生长。

Organelle genome modification of endonuclease guided by polynucleotide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰序列表援引并入本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS-Web提交并通过引用全文并入于此。交叉引用本申请与2017年8月22日提交的美国临时专利申请第62/548,723号相关，该临时申请通过引用全文并入本文。
技术实现思路
在一方面，用于改变细胞器的基因组的方法可以包括：(a)向细胞器中引入包括以下项：(i)编码至少一个指导多核酸的第一多核苷酸，其中至少一个指导多核酸引导多核苷酸指导的多肽切割细胞器基因组中存在的至少一个靶序列；(ii)编码多核苷酸指导的多肽的第二多核苷酸，其中多核苷酸指导的多肽在与指导多核酸相关联时切割至少一个靶序列；(iii)任选地，编码至少一个同源细胞器DNA序列的第三多核苷酸，其中至少一个同源细胞器DNA具有足以进行同源重组的大小，其中将至少一个同源细胞器DNA序列整合到细胞器基因组中导致至少一个靶序列的去除；(iv)任选地，编码至少一个选择标记或至少一个筛选标记或两者的第四多核苷酸；其中第四多核苷酸可操作地连接至在细胞器中具有功能的启动子；和(v)任选地，编码在细胞器中具有功能的复制起点的第五多核苷酸；以及(b)在(i)的第一多核苷酸和(ii)的第二多核苷酸均表达的条件下使包含(a)的细胞器的细胞生长。在另一方面，用于改变细胞器的基因组的方法可以包括：(a)将包含以下项的重组DNA构建体引入细胞器中：(i)编码至少一个指导多核酸的第一多核苷酸，其中至少一个指导多核酸引导多核苷酸指导的多肽切割细胞器基因组中存在的至少一个靶序列；(ii)编码多核苷酸指导的多肽的第二多核苷酸，其中多核苷酸指导的多肽在与指导多核酸相关联时切割至少一个靶序列；(iii)任选地，编码至少一个同源细胞器DNA序列的第三多核苷酸，其中至少一个同源细胞器DNA具有足以进行同源重组的大小，其中将至少一个同源细胞器DNA序列整合到细胞器基因组中导致至少一个靶序列的去除；(iv)任选地，编码至少一个选择标记或至少一个筛选标记或两者的第四多核苷酸；其中第四多核苷酸可操作地连接至在细胞器中具有功能的启动子；和(v)任选地，编码在细胞器中具有功能的复制起点的第五多核苷酸；以及(b)在(i)的第一多核苷酸和(ii)的第二多核苷酸均表达的条件下使包含(a)的细胞器的细胞生长在一些实施方案中，该方法可以进一步包括步骤(c)——选择具有包含改变的基因组的细胞器的细胞。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括步骤(d)——选择对于细胞器的改变的基因组是同质的细胞。在一些实施方案中，该方法可以包括将(iii)的第三多核苷酸引入细胞器中，其中(iii)的第三多核苷酸可以包含第六多核苷酸和第七多核苷酸，其中第六多核苷酸和第七多核苷酸对应于细胞器基因组中两个同源的相邻区域，其中第六多核苷酸和第七多核苷酸被与细胞器DNA异源的序列隔开。在一些实施方案中，与细胞器DNA异源的序列可以包含选自以下的至少一项：第一多核苷酸、第二多核苷酸、第四多核苷酸、第八多核苷酸及其任何组合，其中第八多核苷酸编码与细胞器异源的RNA。在另一个实施方案中，至少一个指导多核酸可以存在于多顺反子转录单元上。在一些实施方案中，在多顺反子转录单元转录后，可以通过使用选自以下的至少一项从多顺反子RNA加工出至少一个指导多核酸：RNA切割位点、Csy4切割位点、核酶切割位点、多核苷酸指导的多肽切割位点、tRNA序列的存在及其任何组合。在一些实施方案中，多顺反子RNA可以包含在至少一个指导RNA的5’的第一tRNA序列和在至少一个指导RNA的3’的第二tRNA序列。在另一个实施方案中，该方法可以包括第八多核苷酸，其中第八多核苷酸可以编码选自以下的至少一项：除草剂耐受性蛋白、杀虫蛋白、与杀虫蛋白结合的辅助蛋白、dsRNA、siRNA、miRNA及其任何组合，其中dsRNA、siRNA和miRNA抑制植物害虫中存在的至少一个靶基因。在一些实施方案中，该方法可以包括第八多核苷酸，其中第八多核苷酸可以可操作地连接至在细胞器中有活性的至少一个调控元件。在一些实施方案中，至少一个调控元件可以是启动子。在另一个实施方案中，选自以下的至少一项：第一多核苷酸、第二多核苷酸、第四多核苷酸、第五多核苷酸及其任何组合，可以位于以第六多核苷酸和第七多核苷酸为边界的区域之外。在另一个实施方案中，该方法可以包括第四多核苷酸和第五多核苷酸，其中第四多核苷酸和第五多核苷酸均可以位于以第六多核苷酸和第七多核苷酸为边界的区域之外。在另一个实施方案中，该方法可以包括第四多核苷酸，其中第四多核苷酸可以包含编码正选择标记的第一序列和编码负选择标记的第二序列，其中第一序列和第二序列可以各自可操作地连接至在细胞器中具有功能的启动子。在另一个实施方案中，该方法可以包括第五多核苷酸，其中第五多核苷酸可以编码在质体(例如，叶绿体)中具有功能的复制起点，其中在质体中具有功能的复制起点可以对应于来自质体rRNA基因间区域的DNA序列。在另一个实施方案中，该方法可以包括第五多核苷酸，其中第五多核苷酸可以编码在线粒体中具有功能的复制起点。在一些实施方案中，多核苷酸指导的多肽可以选自：Cas9蛋白、MAD2蛋白、MAD7蛋白、CRISPR核酸酶、Cas蛋白的核酸酶结构域、Cpf1蛋白、Argonaute、其修饰形式及其任何组合。在一些实施方案中，重组DNA构建体可以进一步包含彼此有至少100个核苷酸具有100％序列同一性的第九多核苷酸和第十多核苷酸，其中第九多核苷酸和第十多核苷酸作为直接重复序列排列在重组DNA构建体中。在一些实施方案中，重组DNA构建体可以是线性的，并且进一步地，其中第九多核苷酸和第十多核苷酸可以存在于重组DNA构建体的5’和3’端在另一个实施方案中，该方法可以包括重组DNA构建体，其包含选自以下的至少一项：第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第四多核苷酸、第五多核苷酸及其任何组合。在一些实施方案中，该方法可以包括超过一个此类重组DNA构建体。在另一个实施方案中，重组DNA构建体可以进一步包含第九多核苷酸和第十多核苷酸，其中第九多核苷酸和第十多核苷酸可以彼此具有100％序列同一性，并且进一步地，其中第九多核苷酸和第十多核苷酸可以作为直接重复序列排列在重组DNA构建体中。在一些实施方案中，第九多核苷酸和第十多核苷酸可以彼此有至少20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸具有100％的序列同一性。任选地，重组DNA构建体可以是线性的，并且第九多核苷酸和第十多核苷酸存在于重组DNA构建体的5’和3’端。在另一个实施方案中，本文的任何方法均可以进一步涉及将编码至少一个选择标记的多核苷酸引入细胞器中，该至少一个选择标记选自：正选择标记、负选择标记及其任何组合。在一些实施方案中，正选择标记可以是除草剂耐受性蛋白。在一些实施方案中，除草剂耐受性蛋白可以是选自以下的至少一项：4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、耐磺酰脲的乙酰乳酸合酶(ALS)、耐咪唑啉酮的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于改变细胞器的基因组的方法，所述方法包括：/na.将包含以下项的重组DNA构建体引入细胞器中：/ni.编码至少一个指导RNA的第一多核苷酸，其中所述至少一个指导RNA引导多核苷酸指导的多肽切割细胞器基因组中存在的至少一个靶序列；/nii.编码多核苷酸指导的多肽的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸指导的多肽在与所述指导RNA相关联时切割所述至少一个靶序列；/niii.任选地，编码至少一个同源细胞器DNA序列的第三多核苷酸，其中所述至少一个同源细胞器DNA具有足以进行同源重组的大小，其中将所述至少一个同源细胞器DNA序列整合到所述细胞器基因组中导致所述至少一个靶序列的去除；/niv.任选地，编码至少一个选择标记或至少一个筛选标记或两者的第四多核苷酸；其中所述第四多核苷酸可操作地连接至在所述细胞器中具有功能的启动子；和/nv.任选地，编码在所述细胞器中具有功能的复制起点的第五多核苷酸；以及/nb.在(i)的所述第一多核苷酸和(ii)的所述第二多核苷酸均表达的条件下使包含(a)的所述细胞器的细胞生长。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170822 US 62/548,7231.一种用于改变细胞器的基因组的方法，所述方法包括：
a.将包含以下项的重组DNA构建体引入细胞器中：
i.编码至少一个指导RNA的第一多核苷酸，其中所述至少一个指导RNA引导多核苷酸指导的多肽切割细胞器基因组中存在的至少一个靶序列；
ii.编码多核苷酸指导的多肽的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸指导的多肽在与所述指导RNA相关联时切割所述至少一个靶序列；
iii.任选地，编码至少一个同源细胞器DNA序列的第三多核苷酸，其中所述至少一个同源细胞器DNA具有足以进行同源重组的大小，其中将所述至少一个同源细胞器DNA序列整合到所述细胞器基因组中导致所述至少一个靶序列的去除；
iv.任选地，编码至少一个选择标记或至少一个筛选标记或两者的第四多核苷酸；其中所述第四多核苷酸可操作地连接至在所述细胞器中具有功能的启动子；和
v.任选地，编码在所述细胞器中具有功能的复制起点的第五多核苷酸；以及
b.在(i)的所述第一多核苷酸和(ii)的所述第二多核苷酸均表达的条件下使包含(a)的所述细胞器的细胞生长。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：(c)选择具有包含改变的基因组的细胞器的细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括：(d)选择对于所述细胞器的所述改变的基因组是同质的细胞。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞器是质体。


5.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞器是线粒体。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其包括(iii)的所述第三多核苷酸，其中(iii)的所述第三多核苷酸包含第六多核苷酸和第七多核苷酸，其中所述第六多核苷酸和所述第七多核苷酸对应于所述细胞器基因组中两个同源的相邻区域，其中所述第六多核苷酸和所述第七多核苷酸被与所述细胞器DNA异源的序列隔开。


7.根据权利要求6所述的方法，其中与所述细胞器DNA异源的所述序列包含选自以下的至少一项：所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸、所述第四多核苷酸、第八多核苷酸及其任何组合，其中所述第八多核苷酸编码与所述细胞器异源的RNA。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一个指导RNA存在于多顺反子转录单元上。


9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述多顺反子转录单元的转录之后，通过使用选自以下的至少一项从多顺反子RNA加工出所述至少一个指导RNA：RNA切割位点、Csy4切割位点、核酶切割位点、多核苷酸指导的多肽切割位点、tRNA序列的存在及其任何组合。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多顺反子RNA包含在所述至少一个指导RNA的5’的第一tRNA序列和在所述至少一个指导RNA的3’的第二tRNA序列。


11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其包括所述第八多核苷酸，其中所述第八多核苷酸编码选自以下的至少一项：除草剂耐受性蛋白、杀虫蛋白、与杀虫蛋白结合的辅助蛋白、dsRNA、siRNA、miRNA及其任何组合，其中所述dsRNA、所述siRNA和所述miRNA抑制植物害虫中存在的至少一个靶基因。


12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其包括所述第八多核苷酸，其中所述第八多核苷酸可操作地连接至在细胞器中有活性的至少一个调控元件。


13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中选自以下的至少一项：所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸、所述第四多核苷酸、所述第五多核苷酸及其任何组合，位于以所述第六多核苷酸和所述第七多核苷酸为边界的区域之外。


14.根据权利要求13所述的方法，其包括所述第四多核苷酸和所述第五多核苷酸，其中所述第四多核苷酸和所述第五多核苷酸均位于以所述第六多核苷酸和所述第七多核苷酸为边界的区域之外。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其包括所述第四多核苷酸，其中所述第四多核苷酸包含编码正选择标记的第一序列和编码负选择标记的第二序列，其中所述第一序列和所述第二序列各自可操作地连接至在所述细胞器中具有功能的启动子。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其包括所述第五多核苷酸，其中所述第五多核苷酸编码在质体中具有功能的复制起点，其中在质体中具有功能的所述复制起点对应于来自质体rRNA基因间区域的DNA序列。


17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其包括所述第五多核苷酸，其中所述第五多核苷酸编码在线粒体中具有功能的复制起点。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸指导的多肽选自：Cas9蛋白、MAD2蛋白、MAD7蛋白、CRISPR核酸酶、Cas蛋白的核酸酶结构域、Cpf1蛋白、Argonaute、其修饰形式及其任何组合。


19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述重组DNA构建体进一步包含彼此有至少100个核苷酸具有100％序列同一性的第九多核苷酸和第十多核苷酸，其中所述第九多核苷酸和所述第十多核苷酸作为直接重复序列排列在所述重组DNA构建体中。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述重组DNA构建体是线性的，并且进一步地，其中所述第九多核苷酸和所述第十多核苷酸存在于所述重组DNA构建体的5’和3’端。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将编码至少一个选择标记的多核苷酸引入所述细胞器中，所述至少一个选择标记选自：正选择标记、负选择标记及其任何组合。


22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法进一步涉及在正选择剂的存在下使所述细胞生长，并选择对于所述细胞器的所述改变的基因组是同质的细胞。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法进一步涉及在不存在所述正选择剂的情况下使所述细胞生长，然后选择缺乏非整合的重组DNA构建体的细胞。


24.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法进一步涉及在不存在所述正选择剂的情况下使所述细胞生长，然后在负选择剂的存在下使所述细胞生长，然后选择缺乏非整合的重组DNA构建体的细胞。


25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞，其中所述细胞器是质体或线粒体，并且其中所述方法进一步包括从包含改变的细胞器基因组的所述植物细胞再生植物。


26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞或藻类细胞。


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【专利技术属性】
技术研发人员：哈吉米·萨凯，俞炳春，小艾米·迈耶·奥罗斯科，罗杰·怀斯，加内什·基肖尔，杰伊·基斯林，纳伦德拉·辛格·亚达夫，
申请(专利权)人：纳匹基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US