本发明专利技术公开了牛A-FABP基因单核苷酸多态性位点及其检测方法，以包含A-FABP基因的待测牛全基因组DNA为模版，以引物对P1为引物，PCR扩增牛A-FABP基因，然后进行SSCP多态性检测。其基因多态性位点包括：在牛的A-FABP基因第2989位为A或G的碱基多态性。本发明专利技术把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。
【技术实现步骤摘要】
—种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法，以牛的肉用性状基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及牛的A-FABP (脂肪型脂肪酸结合蛋白)基因的单核苷酸多态性位点及其应用。
技术介绍
随着经济的发展，人们对于牛肉的数量和品质要求日益提高。虽然我国已成为第三大养牛与牛肉生产国，但是高档大部分依赖于进口。因此提高肉用性能势在必行，途径主要有改善饲料营养，加强饲养管理水平和培育优良品种等，而良种是肉牛业发展的先决条件和物质基础。人们在了解肉用性状的遗传规律和相应的生长发育、脂肪沉积等生命活动调控规律的基础上，结合分子生物学方面的研究，发现了与肉用性状有密切联系的功能基因和主效基因以及和这些基因连锁的分子遗传标记，根据目标性状与候选基因基因型间的关联性进行选择，提高了育种方向的准确性，缩短了育种年限。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种:一种是同义cSNP (synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP (non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。分子生物学的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因某位点的多态性，对不同基因型个体与其生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，为选种提供依据，这一过程中检测多态性和基因分型的准确是很关键的。目前主要的方法有PCR-RFLP技术或PCR-SSCP技术结合DNA测序。A-FABP基因编码脂肪型脂肪酸结合蛋白，在脂肪细胞中高度表达，牛A-FABP基因能通过调控激素敏感酯酶HSL的功能，在脂质水解和细胞内脂肪酸转运中发挥关键作用。同时，脂肪型脂肪酸结合蛋白可在细胞内与脂肪酸结合，造成细胞内外脂肪酸浓度差，从而促进细胞摄取脂肪酸，并能在脂肪细胞中沉积甘油三酯，提高肌内脂肪含量。而随着肌内脂肪含量的增加，肉的嫩度、风味、多汁性等都得到了改善，大理石纹评分更加理想，提高了牛肉的品质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛A-FABP基因SNP的筛查和检测方法，本专利技术解决的问题在于利用PCR产物混合测序的方法筛查牛A-FABP基因的多态性位点。通过关联分析寻找与牛肉质性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为牛分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提闻种群品质。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 本专利技术根据A-FABP基因的外显子设计引物，分别以8种牛品种的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，对PCR产物混合并纯化，测序后得到牛A-FABP的部分序列。一种用于检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的引物，所述的引物对Pl为:正向引物 F: 5’ -AGGCGTGGGCTTTGCTAC-3’ ；反向引物 R: 5’ -GAATGGCTTTCCTCCTTCTACA-3’。一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤: (1)以包含A-FABP基因的待测牛基因组DNA为模版，以引物对Pl为引物，PCR扩增牛A-FABP 基因； (2)对步骤⑴的扩增产物进行PCR目的片段检测； ⑶对步骤⑵的目的片段进行PCR-SSCP检测:首先对目的片段分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性位点。所述多态性位点包括:在牛的A-FABP基因第2989位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA、AG、GG三种基因型。所述的PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s ;60°C退火40s ；72°C延伸30s ;72°C延伸7min ;4°C保存。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。用变性剂对PCR扩增产物进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定牛A-FABP基因是否有多态性。所述的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10%。所述的根据PCR-SSCP分析结合DNA测序结果显示，A-FABP基因片段2843-3109(命名为AF-1片段)有AA、AG、GG3种基因型。本专利技术对8个牛品种上述SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也对SSCP多态位点与牛肉质性状之间进行了关联分析。本专利技术的优点在于: 与现有技术相比，本专利技术把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变点的漏检，提供了一种简单、快速、精确度高的方法，便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。【附图说明】图1是引物Pl扩增不同牛个体(牛A-FABP基因第2989位多态位点)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为600bp Marker, 1-9为PCR产物。图2是本专利技术中PCR产物混合测序筛查到的牛A-FABP基因序列第2989为A或G突变测序结果图。图3是本专利技术牛A-FABP基因第2989位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中I为AA型，4为GG型，2、3、5为AG型。【具体实施方式】为使本专利技术的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本专利技术进一步说明。本专利技术根据A-FABP基因的外显子和内含子设计引物，分别以8个牛群体的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和肉质性状的关联分析，筛选出与牛肉质性状密切相关的分子标记。下面对本专利技术做详细说明，所述是本专利技术的解释而不是限定。实施例1 一、牛A-FABP基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测 1、牛样品的采集和处理 本专利技术采用8个牛群体共计318个个体，具体为:(I)安格斯(Angus)牛血液样品18份，晋南牛(Jinnan)血液样品23份,利木赞(Limousin)牛血液样品22份,鲁西黄牛(Luxi)血液样品29份,秦川牛(Qinchuan)血液样品27份,西门塔尔(Simmental)牛血液样品30份，夏洛莱(Charolais)牛血液样品29份，采自河北大厂县华安肉牛育肥场；(2)安格斯(Angus)牛血液样品30份,海福特(Hereford)牛血液样品30份,西门塔尔(Simmental)牛血液样品28份，采自内蒙古通辽三元肉牛育肥场；(3)西门塔尔(Simmen本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测肉牛A‑FABP基因单核苷酸多态性的引物，其特征在于：所述的引物对P1为：正向引物F:5'‑AGGCGTGGGCTTTGCTAC‑3'；反向引物R:5'‑GAATGGCTTTCCTCCTTCTACA‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的引物，其特征在于:所述的引物对Pl为:正向引物F:5’-AGGCGTGGGCTTTGCTAC-3’ ；反向引物R:5’-GAATGGCTTTCCTCCTTCTACA-3’ 。2.一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)以包含A-FABP基因的待测牛基因组DNA为模版，以引物对Pl为引物，PCR扩增牛A-FABP 基因； (2)对步骤⑴的扩增产物进行PCR目的片段检测； ⑶对步骤⑵的目的片段进行PCR-SSCP检测:首先对目的片段分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判...
【专利技术属性】
技术研发人员：甘乾福，乔慧，梁学武，陈佳钦，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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