【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶特异性CRISPR变体
本专利技术涉及人工工程化CRISPR/Cas9系统。更具体而言，本专利技术涉及具有改善的靶特异性的人工工程化CRISPR酶，以及使用包含CRISPR酶的人工工程化CRISPR/Cas9系统用于基因组和/或表观基因组操纵或修饰、基因组靶向、基因组编辑以及体外诊断等的用途。
技术介绍
CRISPR-Cas系统由引导RNA(gRNA)(其具有针对靶基因或核酸的互补序列)和CRISPR酶(其为可切割靶基因或核酸的核酸酶)组成，其中，gRNA和CRISPR酶形成CRISPR复合体，并且所形成的CRISPR复合体切割或修饰靶基因或核酸。然而，除修饰靶基因或核酸的效果外，尚未解决对不期望的非靶基因或核酸进行修饰的问题。非靶基因或核酸为具有与gRNA部分互补的序列并且可与gRNA形成部分互补的键的基因位点，其中，由于部分互补的结合，CRISPR复合体可切割或修饰相应的基因位点，而该基因位点为并不是修饰对象的非靶基因或核酸。因此，为提高使用CRISPR-Cas系统特异性修饰靶基因或核酸的效率或解决诸如...
【技术保护点】
1.一种具有改善的靶特异性的包含人工操纵的SpCas9变体，/n其中，所述人工操纵包括对存在于选自于野生型酿脓链球菌Cas9(SpCas9)的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的人工操纵。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170707 US 62/529,601;20171221 US 62/608,7221.一种具有改善的靶特异性的包含人工操纵的SpCas9变体，
其中，所述人工操纵包括对存在于选自于野生型酿脓链球菌Cas9(SpCas9)的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的人工操纵。
2.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第一区域为选自于由以下部分所组成的组中的一个或多个部分：与gRNA相互作用的野生型SpCas9的部分、与靶序列相互作用的野生型SpCas9的部分、与gRNA-靶序列异源双链相互作用的野生型SpCas9的部分以及与gRNA-靶序列异源双链的PAM(前间区序列邻近基序)远端相互作用的野生型SpCas9的部分。
3.如权利要求2所述的SpCas9变体，
其中，所述gRNA-靶序列异源双链的PAM远端为远离PAM位置的所述gRNA-靶序列异源双链的末端处的6-10个碱基对。
4.如权利要求3所述的SpCas9变体，
其中，所述PAM为5'-NGG-3'。
5.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第二区域和第三区域为执行切割核酸的功能的野生型SpCas9的部分。
6.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第四区域为选自于由以下部分所组成的组中的一个或多个部分：识别靶基因或核酸中的PAM序列或与靶基因或核酸中的PAM序列相互作用的野生型SpCas9的部分以及与gRNA的核苷酸序列的一部分相互作用的野生型SpCas9的部分。
7.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第一区域为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于所述野生型SpCas9的REC叶中的区域、所述野生型SpCas9的整个REC结构域以及所述野生型SpCas9的REC结构域的一部分。
8.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第二区域为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于所述野生型SpCas9的NUC叶中的区域、所述野生型SpCas9的整个RuvC结构域、所述野生型SpCas9的RuvC结构域的一部分以及所述野生型SpCas9的RuvC结构域的包含金属依赖性核酸切割区域的部分。
9.如权利要求8所述的SpCas9变体，
其中，所述RuvC结构域的金属依赖性核酸切割区域为RuvC结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
10.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第三区域为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于所述野生型SpCas9的NUC叶中的区域、所述野生型SpCas9的整个HNH结构域、所述野生型SpCas9的HNH结构域的一部分以及所述野生型SpCas9的HNH结构域的包含金属依赖性核酸切割区域的部分。
11.如权利要求10所述的SpCas9变体，
其中，所述HNH结构域的金属依赖性核酸切割区域为HNH结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
12.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述野生型SpCas9的第四区域为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于所述野生型SpCas9的NUC叶中的区域、所述野生型SpCas9的整个PI结构域以及所述野生型SpCas9的PI结构域的一部分。
13.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第一区域包含选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：由所述野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列组成的区域1-1、由所述野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列组成的区域1-2、由所述野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列组成的区域1-3以及由所述野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列组成的区域1-4。
14.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第一区域包含所述野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
15.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第二区域包含选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：由所述野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列组成的区域2-1、由所述野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列组成的区域2-2以及由所述野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列组成的区域2-3。
16.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第二区域包含所述野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
17.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第三区域包含由所述野生型SpCas9的第775位的赖氨酸(K775)至第900位的亮氨酸(L900)的氨基酸序列组成的区域3-1。
18.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第三区域包含所述野生型SpCas9的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
19.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第四区域包含由所述野生型SpCas9的第1099位的谷氨酸(E1099)至第1139位的缬氨酸(V1139)的氨基酸序列组成的区域4-1。
20.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，所述第四区域包含所述野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
21.如权利要求1所述的SpCas9变体，
其中，存在于选自于所述野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区...
【专利技术属性】
技术研发人员：金荣勋，郑民熙，李俊善，辛恩智，李康寅，金奭中，李政埈，
申请(专利权)人：株式会社图尔金，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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