一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用，所述突变型限制性内切酶BsaI具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。本发明专利技术通过对野生型限制性内切酶BsaI及进行多位点氨基酸突变，得到突变型限制性内切酶BsaI，所得酶稳定性好，酶活和纯度满足市场需要，且价格低廉。

A mutant restriction endonuclease bsai and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用。
技术介绍
在生物体内有一类能将外来的DNA切断的酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，这样就可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。由于细菌体内存在“限制-修饰”现象，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制酶对自身DNA片段的切割，达到抵御外来噬菌体侵染的目的。因此在原核表达体系中单一的重组表达限制酶，会使宿主因DNA被切割而死亡。而甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护,保护完成后再表达限制酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA。随着“限制-修饰”现象被发现，科学家WernerArben，DanielNathans和HamiltonSmith发现了限制性内切酶，阐明了限制性内切酶在分子基因问题上的作用，之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。关于限制性内切酶的研究，多年来着重于它们作为工具酶的实用价值，包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中BsaI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可识别六个碱基的核酸序列(5’GGTCTCN^NNNN^3’)，属于TypeIIs型，IIs型限制性内切酶结合不对称的识别元件，并在识别位点以外进行切割。利用其特性衍生而出的无缝克隆技术GoldenGate克隆，即在同一反应体系中，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的DNA，这种技术能以任何顺序无缝组装多个DNA片段(最多八个)到兼容载体上。BsaI不仅在分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。CN107267545A公开了一种重组BsaI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：(1)表达质粒pCreatSII-BsaI的构建；(2)BsaI蛋白的诱导表达与鉴定；(3)BsaI蛋白的纯化与鉴定。本专利技术通过重组方式将BsaI限制性内切酶基因克隆到含His标签的pCreatSII共表达载体中，在低温条件下表达量达到45％。通过Ni柱亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析得到高活力的重组BsaI限制性内切酶，比活与商业化酶相似。但野生型BsaI面临表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的BsaI限制酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。因此，提供一种表达量高、分离纯化程序简单、蛋白得率高且价格低廉的BsaI限制性内切酶及其制备方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用，本专利技术通过将野生型BsaI限制性内切酶的氨基酸序列进行点突变，得到突变型BsaI限制性内切酶，在保证酶活和纯度的前提下，降低生产成本。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种突变型限制性内切酶BsaI，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。所述SEQIDNO.1的氨基酸序列具体如下所示：MHHHHHHSSGGKKAEYGQGHPIFLEYAEQIIQHKEYQGMPDLRYPDGRIQWEAPSNRKSGIFKDTNIKRRKWWEQKAISIGIDPSSNQWISKTAKLIHPTMRKPCKKCGRIMDLRYSYPTKNLIKRIRKLPYVDESFEIDSLEHILKLDKRLVLQYGDKVYDDLPKLLTCKAVKNIPRLGNDLDTWLNWIDSVYIPSEPSMLSPGAMANPPDRLDGFHSLNECCRSHADRGRWEKNLRSYTTDRRAFEYWVDGDWVAADKLMGLIRTNEQIKKETCLNDNHPGPCSADHIGPISLGFVHRPEFQLLCNSCNSAKNNRMTFSDVQHLINAENNGEEVASWYCKHIWDLRKHDVKNNENALRLSKILRDNRHTAMFILSELLKDNHYLFGSTGLGLQYAERSVSFSNIKIENHIITGQISEQPRDTKYTEEQKARRMRIGFEALKSYIEKENRNALLVINDKIIDKINEIKNILQDIPDEYKLLNEKISEQFNSEEVSDELLRDLVTHLPTKESEPANFKLARKYLQEIMEIVGDELSKMWEDERYVRQTFADLD.本专利技术中，通过对野生型限制性内切酶BsaI氨基酸序列中第149、388、391位的疏水氨基酸进行点突变为亲水氨基酸，得到突变型限制性内切酶BsaI，增加了其可溶性，从而降低纯化难度，提高了产率，其氨基酸序列可以是SEQIDNO.1所示，也可以是与SEQIDNO.1所示序列具有98％以上同源性的多肽，或者与SEQIDNO.1所示氨基酸序列经过多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。第二方面，本专利技术提供如第一方面所述的突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列，优选为如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。SEQIDNO：2的核苷酸序列具体如下所示：ATGCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGGTAAAAAAGCCGAATATGGCCAGGGCCATCCGATTTTCCTGGAGTATGCAGAACAAATTATCCAGCACAAAGAGTACCAGGGTATGCCTGACCTGCGCTACCCGGACGGCCGTATTCAGTGGGAAGCCCCGAGTAATCGCAAAAGTGGTATCTTCAAAGACACCAACATCAAACGTCGTAAGTGGTGGGAACAGAAGGCAATCAGCATTGGCATTGACCCTAGCAGCAACCAGTGGATTAGCAAGACCGCCAAGCTGATTCACCCGACCATGCGCAAACCGTGCAAAAAGTGCGGCCGTATCATGGATCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变型限制性内切酶BsaI，其特征在于，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：/n(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；/n(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；/n(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变型限制性内切酶BsaI，其特征在于，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(II)与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；
(III)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。


2.一种如权利要求1所述的突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列，优选为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。


3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的核苷酸序列。


4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞为原核生物细胞，优选为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌ER2566；
优选地，所述宿主细胞表达甲基转移酶M.BsaI。


5.一种突变型限制性内切酶BsaI的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)构建甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒；
(2)将步骤(1)所得质粒转入非甲基化保护菌株中，得BsaI特异性保护菌株R.BsaI；
(3)构建如权利要求3所述的表达载体，转化步骤(2)所得R.BsaI菌株，得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株；
(4)将步骤(3)所得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株诱导培养，纯化回收产物即得突变型限制性内切酶BsaI。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述甲基转移酶M.BsaI的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
优选地，步骤(1)所述重组表达质粒的构建方法包括甲基转移酶M.BsaI基因的获取，将M.BsaI基因片段无缝克隆至表达载体中，得到甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒pACYC184-M.BsaI；
优选地，所述表达载体包括pACYC184；
优选地，所述M.BsaI基因的获取方式包括PCR扩增、基因合成或者DNA文库构建中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述M.BsaI基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4-5所示；
优选地，步骤(2)所述甲基化保护菌株的筛选方法包括以下步骤：将质粒pACYC184-M.BsaI转化入大肠杆菌ER2566中，培养后提取pACYC184-M.BsaI质粒并用限制性内切酶BsaI消化，筛选甲基化保护菌株使得pACYC184-M.BsaI质粒在菌体内受到甲基转移酶M.BsaI的完全保护；
优选地，步骤(3)所述表达载体的构建包括以下步骤：将突变型限制性内切酶BsaI基因片段进行组氨酸标记后与表达载体相连；
优选地，所述表达载体包括pBAD；
优选地，步骤(4)所述诱导培养的条件为将步骤(3)所述突变型BsaI重组菌株接种到LB培养基中，37℃，180-250rpm，培养至OD0.7-0.9，然后加入诱导剂，20-30℃，180-250rpm，培养15-20h；
优选地，所述诱导剂包括阿拉伯糖；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤晓，程槐旭，胡梦竹，燕东平，聂尚海，
申请(专利权)人：莫纳武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42