用于多种参数的对照核酸制造技术

本发明专利技术关注出于定性和/或定量目的使用内部对照核酸来扩增可能存在于至少一份流体样品中的至少第一和第二靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于体外诊断学领域。具体而言，在此领域内，其关注出于定性和/或定量目的使用内部对照核酸来扩增可能存在于至少一份流体样品中的至少第一和第二靶核酸。
技术介绍
在分子诊断学领域中，自多种来源扩增核酸具有相当大的意义。核酸扩增和检测的诊断性应用的例子是对病毒诸如人乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗病毒(WNV)的检测，或者针对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)的存在的献血常规筛选。此外，所述扩增技术适用于细菌性靶物诸如分枝杆菌，或对肿瘤标志物的分析。最突出且广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应包含连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口 -LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和QP扩增，等等。用于基于PCR的分析的自动化系统经常利用PCR过程期间在同一反应容器中对产物扩增的实时检测。这类方法的关键是使用携带报告物基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。已经显示了在同一容器中对超过一种靶核酸的扩增和检测是有可能的。该方法通常称作“多重”扩增，并且如果实施实时检测，那么需要不同标记物进行区别。在临床核酸诊断学领域中通常期望或甚至强制的是，出于定性(性能对照)和/或定量(使用对照作为参照物来测定靶核酸的量)目的使用具有已知序列的对照核酸来控制相应的扩增。鉴于特别是诊断性靶物，包括原核、真核以及病毒核酸的多样性，且鉴于不同类型的核酸诸如RNA和DNA之间的多样性，通常以特异性方式设计对照核酸。简言之，这些对照通常类似于它们为之充当对照的靶核酸，从而在该过程期间模拟其特性。这种情况适用于定性和定量测定法两者。如果要在单个或平行的实验中检测多种参数，那么通常采用类似不同祀核酸的不同对照，诸如例如在Swanson等(J.Clin.Microbiol., (2004), 42,第 1863 页-第 1868 页)中。Stdeher等(J.Virol.Meth.(2003)，108，第 I 页-第 8 页)披露了一种对照核酸，其中在同一 DNA分子上包含多种病毒特异性竞争性对照。本专利技术提供了一种受控的扩增方法，其使用一种展示多种优点的不同办法进行。专利技术描述本专利技术提供了一种用于受控扩增可能存在于流体样品中的至少第一和第二靶核酸的方法。 在第一个方面，本专利技术涉及用于分离及同时扩增可能存在于一份或多份流体样品中的至少第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自动化步骤:a.向每份所述流体样品添加内部对照核酸b.在一个或多个容器中将固体支持材料和所述一份或多份流体样品在一定条件下组合在一起达一段时间，该条件和时间段足以允许包含所述靶核酸和所述内部对照核酸的核酸在所述固体支持材料上固定化 c.在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述流体样品中的其它材料分离d.在所述分离站中纯化所述核酸，并将所述固体支持材料用清洗缓冲液清洗一次或多次e.在至少两个反应容器中使纯化的靶核酸和纯化的内部对照核酸与一种或多种扩增试剂接触，所述扩增试剂包含针对每一种所述靶核酸和针对所述内部对照核酸的至少一组独特引物，其中至少第一反应容器至少包含所述第一靶核酸，且至少第二反应容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述第二靶核酸不存在于第一反应容器中f.在所述反应容器中将所述纯化的靶核酸和所述纯化的内部对照核酸与所述一种或多种扩增试剂在一定条件下一起温育一段时间，所述条件和时间段足以发生指示所述靶核酸存在或缺乏的扩增反应g.检测并测量由所述靶核酸的扩增产物生成并与所述靶核酸浓度成比例的信号，以及检测并测量由所述内部对照核酸生成的信号，其中步骤d.至g.中用于扩增和检测的条件对于所述至少第一和第二纯化的靶核酸和所述内部对照核酸是相同的，且其中所述内部对照核酸的序列对于所述至少第一和第二纯化的靶核酸是相同的。本专利技术允许对多种参数和/或核酸类型在对所述不同参数和/或核酸类型使用相同内部对照核酸序列的情况中开发同时测定法。因此，它促成在多种水平上降低相应实验的总体复杂性:例如,仅必须设计一种内部对照核酸序列，并且添加至相应的扩增混合物，如此节省用于设计和合成或购买多种对照核酸序列的时间和成本。可以将一种或多种测定法流线化(streamline),并且降低操作错误的风险。另外,在相同条件下同时实施的一个测定法或平行测定法中采用的不同对照核酸序列越多，调节相应条件可能产生的结果越复杂。此外，凭借适合于多种核酸的单一对照，可以将所述对照从单一来源分配入例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本专利技术的范围内，单一对照核酸序列也可以充当定性及充当定量对照。作为上文所描述的方法的进一步的优点，在可能的后续实验中对特定生物学样品测试其它核酸不需要牵涉另一样品制备规程及添加不同内部对照核酸，因为可以使用本专利技术中使用的对照来控制不同 核酸的扩增。因此，一旦已经添加内部对照核酸，可以在相同条件下在同一样品中测试其它参数。内部对照核酸可以是竞争性、非竞争性或部分竞争性的。竞争性内部对照核酸携带与靶物基本上相同的引物结合位点，并且由此与靶物竞争相同引物。虽然此原理允许对相应靶核酸的良好模拟(由于其类似结构)，但是它可以降低就一种或多种靶核酸而言的扩增效率，并且因此导致测定法不太灵敏。非竞争性内部对照核酸具有不同于靶物的引物结合位点，并且如此结合不同引物。这类设置的优点包含如下的事实，即反应混合物中不同核酸的单一扩增事件可以在没有任何竞争效应的情况中彼此独立发生，等等。因此，对该测定法的检测限没有发生不利影响，就像可以是在竞争性设置中的情况。最后，在使用部分竞争性设置的扩增中，相应的对照核酸和至少一种靶核酸竞争相同引物，而至少一种其它靶核酸结合不同引物。如下的事实使所述方法变得相当灵活，即上文所描述的方法牵涉针对每一种所述靶核酸和针对所述内部对照核酸的一组独特引物。在此非竞争性设置中，没有必要将靶物特异性结合位点引入对照核酸中(如在竞争性设置的情况中)，并且避免如上文提及的竞争性设置的缺点。在非竞争性设置中，内部对照核酸具有不同于任何靶序列的序列，从而不竞争它们的引物和/或探针。优选地，内部对照核酸的序列不同于流体样品中的其它核酸序列。举例而言，如果流体样品自人衍生，那么优选地，内部对照核酸没有也内源存在于人内的序列。如此，序列差异应该至少足够显著，从而不容许引物和/或探针在严格条件下对相应的一种或多种内源核酸的结合，并且如此，使得设置变为竞争性的。为了避免这类干扰，优选地，本专利技术中使用的内部对照核酸序列自与流体样品起源不同的来源衍生。优选地，其自天然存在的基因组，优选地植物基因组，进一步优选地葡萄基因组衍生。在一个非常优选的实施方案中，自天然存在的基因组衍生的核酸是混杂的(scrambled)。如本领域中已知的，“混杂”意味着在序列中以某种程度引入碱基突变。优选地，本专利技术中使用的内部对照核酸的序列相对于衍生其的天然存在的基因是实质性改变的。包括上文提及的自动化步骤的方法还展示出多种额外的优点:在现有技术中的一项挑战是，在单个反应容器中实施的多重测定法中的不同靶核酸数目受限于合适标记物的数目。例如在实时PCR测定法中，荧光染料光谱的潜在重叠对测定法性能(假阳性结果的风险、较低的精确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M埃克霍夫，N希齐格，D齐默尔曼，SG威尔，EH菲斯，J格劳比茨，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：