本发明专利技术公开了一种抗口蹄疫病毒miRNA载体，载体上有针对FMDV 3C蛋白的3C1片段序列、3C2片段序列及针对FMDV 3D蛋白的3D1片段序列、3D2片段序列。该载体可以突破血清型的壁垒，解决传统疫苗免疫血清型不能交叉保护的问题；可有效的激活细胞免疫；而使用减毒鼠伤寒沙门氏菌作为疫苗活载体具有能够激发宿主产生针对其所携带外源抗原的特异性免疫应答，增强粘膜、细胞免疫的功能，制备简单，易于储存运输，抗原无需提纯、成本低廉等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种抗口蹄疫病毒感染的四联miRNA及构建方法
本专利技术分子生物学领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒miRNA载体的构建方法及应用。
技术介绍
口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)又称口疮热(aphthousfever)，是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性及高度传染性的疾病。口蹄疫的爆发带来的经济损失和对农业、政治的不良影响极其恶劣。因此，世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为必须上报的动物类A类传染病。口蹄疫易感动物为牛、绵羊、山羊和猪等30多种偶蹄目动物。其传播特征具有传播范围广、易感动物多、感染剂量低、感染后排毒量高、传播速度快等，因此曾多次在世界上爆发及流行。患病动物潜伏期36h至7d，病初体温升高、精神抑郁、食欲低下，继而在口腔粘膜、唇舌部、趾间、蹄冠、乳房出现水疱，水疱破裂后常发生融合，形成弥漫性损害。口蹄疫可引起患病动物继发乳腺炎从而降低产奶量，生产性能下降，甚至造成幼畜死亡。另外，口蹄疫的爆发还可引起国家和地区之间的贸易限制如禁止动物及其产品的出口，继而造成更巨大的损失。因此，FMD的爆发与流行已经上升为影响国际关系、国家声誉和国家经济发展的问题，在国际上素有“政治经济病”之称。近年，FMD在南亚及德法等欧洲国家相继传播，并带来巨大的经济损失。口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，是单股正链RNA病毒。目前有7个血清主型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaI，各型之间无交叉保护反应。每一主型又分若干亚型，迄今为止已发现的亚型有65个且仍在不同的地区出现新的变异株或新的亚型。FMDV病毒粒子直径为(23±2)nm，大致呈圆形，无囊膜。FMDV的结构和成分均较简单，成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余70％为蛋白质。FMDV的基因组全长约8500nt，由5’非编码区(untranslatedregion，UTR)、开放阅读框架(openreadingframe，ORF)和3’UTR构成。5’端共价连接一种特殊的小蛋白VPg，接着是约1300nt的5’UTR，包括S片段(smallfragment)、聚胞嘧啶区(PolyC)和内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite，IRES)等。3’UTR由Poly(A)尾及ORF和Poly(A)尾之间的92nt组成，全长为172nt。基因组中部是一大开放阅读框用于编码一多聚蛋白，该多聚蛋白经三级裂解后，形成3-4种结构蛋白：VP0或VP4、VP2、VP3、VP1，和8-9种非结构蛋白：Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C、和3D。FMDV侵染细胞的必要条件为吸附宿主细胞，而吸附过程依赖于宿主细胞受体。当FMDV颗粒表面的宿主识别位点与靶细胞胞膜上的受体位点结合后，即通过吞噬作用进入宿主细胞胞质内。当宿主胞内溶酶体因病毒介入而释放后，随即将FMDV生存环境转变为酸性，从而导致FMDV颗粒周围酶类降解。由于酶类降解导致FMDV衣壳蛋白构象发生变化，衣壳蛋白迅速膨胀，从而导致FMDV基因RNA经由吞噬小泡膜上的通道释放，并随之进行自身RNA复制、翻译及蛋白装配。在FMDV感染宿主细胞之后，导致其发生细胞病变或死亡的机制有两个原因：其一为病毒产生的特异性蛋白直接作用于细胞，导致细胞的mRNA翻译受到抑制。同时，宿主细胞的翻译启动子失活，核糖体被病毒RNA侵占等也是细胞死亡的重要原因；其二为病毒感染机体后，可通过刺激机体细胞产生细胞免疫从而间接诱发细胞凋亡。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是20世纪90年代末发现的1种真核生物细胞在转录后引发基因沉默的分子机制。其广泛定义为RNA引起的同源依赖性基因沉默现象(homology-dependentgenesilencing，HDGs)，狭义定义为外源双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。因此，可以尝试利用RNAi技术对FMDV进行研究和防控。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种抗口蹄疫病毒miRNA载体的构建方法及应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种抗口蹄疫病毒miRNA载体，载体上有针对FMDV3C蛋白3C1片段的干扰序列、3C2片段的干扰序列及针对FMDV3D蛋白3D1片段的干扰序列、3D2片段的干扰序列，其中：3C1片段的编码序列是：TGCTGATCTCAAACTCAAACACTCTGGTTTTGGCCAC(SEQIDNO.9)；3C2片段的编码序列是：TGCTGAACACTCTGTAGTCACTGTCTGTTTTGGCCAC(SEQIDNO.10)；3D1片段的编码序列是：TGCTGATCAAAGGCCGAATAGTCCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGGACTACGGCCTTTGAT(SEQIDNO.11)；3D2片段的编码序列是：TGCTGAGATCATGGTGTAAGTGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACACTCACCATGATCT(SEQIDNO.12)。优选的，载体由目的片段序列串联后连接pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体构建而成。优选的，构建3C1片段序列的引物是：F：5’-ATCTCAAACTCAAACACTCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGATTGTGAGTTTGAGATCAGGA-3’(SEQIDNO.1)；R：5’-ATCTCAAACTCACACTCTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAGAGTGTTTGAGTTTGAGATCAGCA-3’(SEQIDNO.2)。优选的，构建3C2片段序列的引物是：F：5’-AACACTCTGTAGTCACTGTCTCTTTTGGCCACTGACTGACAGACAGTGTACAGAGTGTTCAGGA-3’(SEQIDNO.3)；R：5’-AACACTCTGTACACTGTCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGACAGTGACTACAGAGTGTTCAGCA-3’(SEQIDNO.4)。优选的，构建3D1片段序列的引物是：F：5’-TGCTGATCAAAGGCCGAATAGTCCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGGACTACGGCCTTGTAT-3’(SEQIDNO.5)；R：5’-CCTGATCTCAAACTCACACTCTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAGAGTGTTTGAGTTTGAGATC-3’(SEQIDNO.6)。优选的，构建3D2片段序列的引物是：F：5’-AGATCATGGTGTAAGTGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACACTCACCATGATCTCAGGA-3’(SEQIDNO.7)；R：5’-CCTGAGATCATGGTGAGTGTCCAGTCAGTCAGTGGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗口蹄疫病毒miRNA载体，其特征在于，载体上有针对FMDV 3C蛋白3C1片段的干扰序列、3C2片段的干扰序列及针对FMDV 3D蛋白3D1片段的干扰序列、3D2片段的干扰序列，其中3C1片段的编码序列是：TGCTGATCTCAAACTCAAACACTCTGGTTTTGGCCAC(SEQ ID NO.9)；3C2片段的编码序列是：TGCTGAACACTCTGTAGTCACTGTCTGTTTTGGCCAC(SEQ ID NO.10)；3D1片段的编码序列是：TGCTGATCAAAGGCCGAATAGTCCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGGACTACGGCCTTTGAT(SEQ ID NO.11)；3D2片段的编码序列是：TGCTGAGATCATGGTGTAAGTGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACACTCACCATGATCT(SEQ ID NO.12)。
【技术特征摘要】
1.一种抗口蹄疫病毒miRNA载体，其特征在于，载体上有针对FMDV3C蛋白3C1片段的干扰序列、3C2片段的干扰序列及针对FMDV3D蛋白3D1片段的干扰序列、3D2片段的干扰序列，其中3C1片段的编码序列是：TGCTGATCTCAAACTCAAACACTCTGGTTTTGGCCAC(SEQIDNO.9)；3C2片段的编码序列是：TGCTGAACACTCTGTAGTCACTGTCTGTTTTGGCCAC(SEQIDNO.10)；3D1片段的编码序列是：TGCTGATCAAAGGCCGAATAGTCCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGGACTACGGCCTTTGAT(SEQIDNO.11)；3D2片段的编码序列是：TGCTGAGATCATGGTGTAAGTGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACACTCACCATGATCT(SEQIDNO.12)。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体由目的片段序列串联后连接pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体构建而成。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，构建3C1片段序列的引物是：F：5’-ATCTCAAACTCAAACACTCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGATTGTGAGTTTGAGATCAGGA-3’(SEQIDNO.1)；R：5’-ATCTCAAACTCACACTCTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAGAGTGTTTGAGTTTGAGATCAGCA-3’(SEQIDNO.2)。4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，构建3C2片段序列的引物是：F：5’-AACACTCTGTAGTCACTGTCTCTTTTGGCCACT...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晶，向华，黄元，王晓虎，向蓉，黄忠，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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