包括内部核糖体进入位点的质粒和其用途制造技术

在一些方面，本申请涉及可用于在特异性扰动之后有效监测数千个蛋白的稳定性的质粒的开发。所述质粒允许两种报道基因蛋白的共表达，两种均处于IRES的控制下。本发明专利技术的其它方面涉及质粒文库，识别通过所关注的化合物调节其水平的蛋白的筛选方法以及用于监测用IMiD化合物治疗受试者的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括内部核糖体进入位点的质粒和其用途相关申请案本申请案主张根据2015年4月30日提交的美国临时申请案第62/154,858号和2014年10月10日提交的美国临时申请案第62/062,245号的35U.S.C.§119(e)的权益，每个申请案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。联邦政府资助的研究本专利技术根据美国国立卫生研究院授予的2R01CA068490-19和2R01CA076120-13在政府支持下进行。政府拥有本专利技术中的某些权利。
技术介绍
报道基因测定已经在制药和生物技术工业中常规地使用以识别影响蛋白功能的前导化合物。在近十年中，化学家在短时间内通过如组合化学反应的技术合成大量化学化合物的能力已大大提高，并且常常需要筛选数千到数百万的化合物以识别对所关注蛋白质具有期望效应的那些化合物。通常，报道基因测定测量在样品中的一种报道基因蛋白的活性，但是可结合多种报道基因。用于共表达多种报道基因的一个策略涉及双顺反子构建体的设计，其中通过内部核糖体进入位点(IRES)序列分隔开的两种基因在常见上游启动子的控制下表达为单个转录盒(或双顺反子转录)(延(Yen)等人，《科学(Science.)》2008年11月7日；322(5903)：918-23)。插入IRES序列充当用于有效的帽独立性内部翻译起始的核糖体结合位点。此类设计实现具有IRES引导的帽独立性翻译的两种基因两者的转录。此系统允许在实验处理时不期望改变的对照报道基因与在每个测试样品中归一化为所述对照的测试报道基因一起共表达。然而，相比于帽独立性翻译，在细胞中的许多扰动可差异地影响帽依赖性翻译。此外，一些IRES已经示出显示下游基因的可变表达(王(Wong)等人《基因疗法(GeneTher.)》2002年3月；9(5)：337-44)。这导致高的假阳性和不可靠的报道基因测定。因此，存在用于分析蛋白稳定性的有效高通量方法的需要，其中报道基因活性的非特异性变异用于控制在细胞类蛋白稳定性测定中的固有变化。这使得降低有效且高效地运行HTS测定所需要的数据的错误。
技术实现思路
在一些方面，本公开涉及可用于在特异性扰动之后有效地监测数千蛋白的稳定性的质粒的开发。在一些方面，本公开提供一种DNA质粒。所述质粒包括可操作连接启动子；第一内部核糖体进入位点(IRES)；编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；第二IRES；以及编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框(ORF)融合到编码第一报道基。因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白具有可区分的可检测报道基因信号。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有由其产物产生的可区分信号的酶蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分生物发光信号的生物发光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分荧光信号的荧光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由海肾荧光素酶(Rluc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)组成的群组。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的群组。在一些实施例中，所述启动子为真核启动子或合成启动子。在一些实施例中，所述启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施例中，所述开放阅读框来源于生物体的ORFeome。在一些实施例中，所述开放阅读框编码癌蛋白。在一些实施例中，所述癌蛋白选自由以下组成的群组：MYC、Ikaros家族锌指蛋白1(IKZF1)、Ikaros家族锌指蛋白3(IKZF3)、干扰素调节因子4(IRF4)、突变体p53、N-Ras、c-Fos和c-Jun。本公开的一些方面涉及包括本文所述的质粒的分离转化的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。根据一些方面，本公开提供一种包括多种质粒的DNA质粒文库，其中每种所述质粒包括以可操作连接的启动子；第一内部核糖体进入位点(IRES)；编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；第二IRES；以及编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。在一些实施例中，每种质粒的所述开放阅读框不同。在一些实施例中，每种质粒的所述开放阅读框来源于生物体的ORFeome。在一些实施例中，所述生物体为哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物为人类。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白具有可区分的可检测报道基因信号。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分生物发光信号的生物发光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分荧光信号的荧光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为选自由海肾荧光素酶(Rluc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)组成的所述群组。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的所述群组。在一些实施例中，所述启动子为真核启动子或合成启动子。在一些实施例中，所述启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子。根据一些方面，本公开提供一种用于识别其水平通过所关注的化合物调节的蛋白的方法，所述方法包括：使用本文所述的质粒文库转化的宿主细胞与所关注的化合物接触；在所述化合物存在和不存在下，测定融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率；识别当在所述化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率与在不存在所述化合物下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率相比增加时具有增加含量的开放阅读框，以及识别当在所述化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率与在所述化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率相比降低时具有降低含量的开放阅读框。在一些实施例中，使用本文所述的质粒文库的转化的宿主细胞与所关注的测试化合物接触包括在所述化合物存在下使所述转化的宿主细胞生长适当的时间。在一些实施例中，所关注的化合物为根据一些方面，本公开提供一种用于监测用IMiD化合物治疗受试者的方法，所述方法包括：测定在用IMiD化合物治疗的受试者的样本中IKZF1和/或IKZF3的含量；以及当与参考含量相比IKZF1和/或IKZF3的含量降低时将所述受试者识别为对所述治疗的应答。在一些实施例中，所述参考含量为在尚未用所述IMiD化合物治疗的对照受试者中IKZF1和/或IKZF3的所述含量。本专利技术的实施例和方面中的每个可独立或组合实践。此外，在此所用的措词和术语是出于说明的目的并且不应该被视为是限制性的。本文“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”以及其变体的使用意指涵盖在其后所列举的项目和其等效物以及额外项目。参照具体实施方式，本专利技术的这些和其它方面以及各种优点和效用将变得显而易见。本专利技术的每个方面可涵盖如将被理解的各种实施例。在本申请案中识别的所有文献以其全部内容以引入方式并入本文。附图说明附图并不打算按比例绘制。在所述附图中，不同的图中所说明的每个相同或几乎相同的组件用类似的数字表示。为了清楚的目的，在每一个附图中可能没有标记每一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA质粒，其包括以可操作连接的(a)启动子，(b)第一内部核糖体进入位点IRES；(c)编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；(d)第二IRES；以及(e)编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框ORF融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.10 US 62/062,245;2015.04.30 US 62/154,8581.一种DNA质粒，其包括以可操作连接的(a)启动子，(b)第一内部核糖体进入位点IRES；(c)编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；(d)第二IRES；以及(e)编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框ORF融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白具有可区分的可检测报道基因信号。3.根据权利要求2所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白为具有由其产物产生的可区分信号的酶蛋白。4.根据权利要求2所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分生物发光信号的生物发光蛋白。5.根据权利要求2所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分荧光信号的荧光蛋白。6.根据权利要求4所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白为选自由海肾荧光素酶Rluc和萤火虫荧光素酶FLuc组成的群组。7.根据权利要求5所述的质粒，其中所述第一和第二报道基因蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的群组。8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的质粒，其中所述启动子为真核启动子或合成启动子。9.根据权利要求8所述的质粒，其中所述启动子包括巨细胞病毒CMV启动子。10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的质粒，其中所述开放阅读框来源于生物体的ORFeome。11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的质粒，其中所述开放阅读框编码癌蛋白。12.根据权利要求11所述的质粒，其中所述癌蛋白选自由以下组成的群组：MYC、Ikaros家族锌指蛋白1IKZF1、Ikaros家族锌指蛋白3IKZF3、干扰素调节因子4IRF4、突变体p53、N-Ras、c-Fos和c-Jun。13.一种包括权利要求1至12中任一权利要求所述的质粒的分离的转化宿主细胞。14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。15.一种包括多种质粒的DNA质粒文库，其中每种所述质粒包括以可操作连接的(a)启动子，(b)第一内部核糖体进入位点IRES；(c)编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；(d)第二IRES；以及(e)编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。16.根据权利要求15所述的质粒文库，其中每种质粒的所述开放阅读框不同。17.根据权利要求15至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·凯林，G·陆，R·米德尔顿，K·K·王，J·E·布拉德内尔，
申请(专利权)人：达纳法伯癌症研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US