修饰的肝炎转录后调节元件制造技术

提供了含有具有变体X基因的修饰的PRE的多核苷酸，其包括一个或多个在未修饰的，如野生型，肝炎X基因中不存在的终止密码子。还提供了含有具有变体X基因的修饰的PRE的多核苷酸，其包括一个或多个在未修饰的，如野生型，肝炎X基因中不存在的降解序列。修饰的PRE可以可操作地连接到编码重组蛋白的核酸。还提供了含有该多核苷酸的表达盒、病毒载体和细胞，及其组合物和使用方法。

Modified post transcriptional regulator of hepatitis

A polynucleotide containing PRE modified by X gene is provided, which includes one or more stop codons that do not exist in unmodified, such as wild-type hepatitis X gene. A polynucleotide containing modified PRE gene with variant X gene is also provided, which includes one or more degradation sequences that do not exist in unmodified, such as wild-type hepatitis X gene. The modified PRE can be operatively connected to the nucleic acid of the encoded recombinant protein. An expression box containing the polynucleotide, a viral vector and a cell, and a composition and a use method are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的肝炎转录后调节元件相关申请的交叉引用本申请要求于2015年1月12日提交的题为“修饰的肝炎转录后调节元件”的美国临时专利申请号62/102,569的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。通过引用纳入序列表本申请与电子格式的序列表一同提交。所提供的序列表名称为735042001840SeqList.txt，创建于2016年1月12日，其文件大小为152,051字节。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本文。
本公开涉及表达重组分子的方法和用于这类方法的多核苷酸。具体地，本公开涉及含有转录后调节元件(PRE)的多核苷酸，其增强与其可操作连接的重组分子的表达，如顺式作用转录后调节元件及其修饰变体。修饰的转录后调节元件包括衍生自肝炎病毒的那些，如土拨鼠肝炎病毒(WHV)，包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的修饰变体。修饰的PRE一般包括一个或多个修饰，其降低了导入对象用于表达重组分子之后肿瘤发生和/或免疫原性的潜力，例如，通过防止某些蛋白质的表达。在一些实施方式中，这类修饰包括在编码病毒X蛋白质或其部分内的序列内的一个或多个终止密码子。在一些实施方式中，多核苷酸包括编码促翻译后修饰，如降解的位点，例如，泛素化位点的一个或多个序列。背景病毒载体可提供用于将遗传物质转移到细胞中的有效递送系统。许多病毒载体，如γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体内的核酸可整合到宿主细胞的基因组中。顺式作用元件，如病毒转录后调节元件(PRE)，包括肝炎病毒PRE及其变体，已经用于病毒载体中以增强基因表达。可获得含有这类元件的核酸、表达盒和载体。需要改善的含PRE核酸、盒和载体。提供了满足上述需求的实施方式。概述提供了含有修饰的转录后调节元件(PRE)的多核苷酸，该元件含有变体X基因，其包括终止密码子和/或翻译后降解序列，其不存在于未修饰的或野生型肝炎病毒X基因，如不存在于来自野生型哺乳动物肝炎病毒，如WHV或HBV的X基因。提供的多核苷酸中是含有修饰的WPRE的那些，其含有包括在未修饰或野生型WHVX基因中不存在的终止密码子和/或翻译后降解序列的变体X基因。提供的多核苷酸包括含有这类修饰的PRE的表达盒和病毒载体。在具体实施方式中，修饰的PRE可操作地连接至编码重组蛋白质，例如异源蛋白质的核酸。提供了含有修饰的PRE的多核苷酸，其包括野生型肝炎病毒X基因的变体，其中变体X基因含有不存在于野生型X基因中的终止密码子，如至少一个终止密码子。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子的每个或第一终止密码子，在对应于野生型X蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的36或24个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于SEQIDNO:1或SEQIDNO:125所示的WHVPRE序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的序列的残基1503的位置的3’方向上的36或24个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体X基因不含长度超过或约39个核苷酸或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。提供了含有修饰的PRE的多核苷酸，其包括野生型肝炎病毒X基因的变体，其中变体X基因含有不存在于野生型X基因中的终止密码子，如至少一个终止密码子，并且在X基因的起始密码子的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对应于野生型X蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于SEQIDNO:1或SEQIDNO:125所示的WHVPRE序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的序列的残基1503的位置的3’方向上的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体X基因具有长度小于或等于33个核苷酸的开放阅读框。在这类修饰的PRE的实施方式的任一个中，不存在于野生型X基因的至少一个终止密码子包括多个终止密码子。提供了含有修饰的PRE的多核苷酸，其含有野生型肝炎病毒X基因的变体，其中变体X基因含有不存在于野生型X基因中的多个终止密码子。在这类实施方式中的任一个中，修饰的PRE含有2、3、4、5或6个终止密码子。在一些实施方式中，多个终止密码子包含在存在于变体X基因的各阅读框中的至少一个终止密码子。在一些实施方式中，多个终止密码子包含在相同阅读框中的至少2个终止密码子。在含有多个终止密码子的修饰的PRE的这类实施方式中的每一个中，多个终止密码子中的一个或多个或者多个终止密码子中的第一终止密码子在对应于野生型X蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的36、30或24个核苷酸内的位置处。在含有多个终止密码子的修饰的PRE的一些实施方式中，多个终止密码子中的一个或多个或者多个终止密码子中的第一终止密码子，在对应于SEQIDNO:1或SEQIDNO:125所示的WHV转录后调节元件(WPRE)序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的WHV序列的残基1503的位置处的3’方向上的36、30或24个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体X基因不含长度超过或约39个核苷酸，长度超过或约30个核苷酸，或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。在这类实施方式的任一个中，提供的多核苷酸也可包含编码重组蛋白质的核酸。在具体实施方式中，修饰的PRE可操作地连接至编码重组蛋白质的核酸。在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对应于野生型X蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的至少或等于9、12、15、18或21个核苷酸内的位置处开始。在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于SEQIDNO:1或SEQIDNO:125所示的WHVPRE序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的序列的残基1503的位置处的3’方向上的至少或等于9、12、15、18、21个核苷酸内的位置的开始。在一些实施方式中，修饰的PRE含有至少一个终止密码子，如1、2、3、4或5个终止密码子，其中多个中的一个或多个终止密码子在对应于SEQIDNO:1或125所示的序列的位置420、423、426、429或432的核苷酸位置处或至少内或内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体X基因不含长度超过或约24个核苷酸，长度超过或约21个核苷酸，长度超过或约18个核苷酸，长度超过或约15个核苷酸，或长度超过或约12个核苷酸的开放阅读框。在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体X基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多核苷酸，其包含：编码重组蛋白的核酸；与所述核酸可操作地连接的修饰的转录后调节元件(PRE)，所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒X基因的变体，所述变体X基因包含不存在于野生型X基因中的终止密码子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.12 US 62/102,5691.一种多核苷酸，其包含：编码重组蛋白的核酸；与所述核酸可操作地连接的修饰的转录后调节元件(PRE)，所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒X基因的变体，所述变体X基因包含不存在于野生型X基因中的终止密码子。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：在所述变体X基因中对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上36或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或在对应于SEQIDNO:1所示的WHV转录后调节元件(WPRE)序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的WHV序列的残基1503的位置的3’方向上36或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。3.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中所述变体X基因不包含长度超过或约39个核苷酸或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。4.一种多核苷酸，包含修饰的转录后调节元件(PRE)，所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒X基因的变体，所述变体X基因包含不存在于野生型X基因的终止密码子，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：在所述变体X基因中对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上32或30个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或在所述变体X基因中对应于SEQIDNO:1所示的WHV转录后调节元件(WPRE)序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的WHV序列的残基1503的位置的3’方向上32或30个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述变体X基因包含长度小于或等于33个核苷酸的开放阅读框。6.如权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含多个终止密码子。7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述多个终止密码子在所述变体X基因中存在的各阅读框中包含至少一个终止密码子和/或在相同阅读框中包含至少2个终止密码子。8.一种多核苷酸，其包含修饰的转录后调节元件(PRE)，所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒X基因的变体，所述变体X基因包含不存在于野生型X基因中的多个终止密码子。9.如权利要求8所述的多核苷酸，其中所述多个终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：在所述变体X基因中对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上36、30或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或在所述变体X基因中对应于SEQIDNO:1所示的WHV转录后调节元件(WPRE)序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的WHV序列的残基1503的位置的3’方向上36、30或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述变体X基因不含长度超过或约39个核苷酸，长度超过或约33个核苷酸，或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。11.如权利要求8-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因包含至少2个终止密码子、至少3个终止密码子或至少4个终止密码子。12.如权利要求8-11中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因在存在于所述变体X基因中的每个阅读框中包含终止密码子。13.如权利要求4-12中任一项所述的多核苷酸，还包含编码与所述修饰的PRE可操作地连接的重组蛋白的核酸。14.如权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：在所述变体X基因中对应于所述X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上9、12、15、或18个核苷酸以内或至少9、12、15、或18个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或在对应于SEQIDNO:1所示的WHV转录后调节元件(WPRE)序列的残基411和/或SEQIDNO:2所示的WHV序列的残基1503的变体X基因中的位置的3’方向上9、12、15、或18个核苷酸以内或至少9、12、15、或18个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中所述变体X基因不包含长度超过或约21个核苷酸，长度超过或约18个核苷酸，长度超过或约15个核苷酸，或长度超过或约12个核苷酸的开放阅读框。16.如权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸，其中：所述修饰的PRE含有对应于SEQIDNO:1的核苷酸残基448-470的β茎环；和/或所述修饰的PRE不含对应于SEQIDNO:1的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸变化；和/或所述一个或多个终止密码子不包含对应于SEQIDNO:1的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸。17.如权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子选自琥珀(TAG)、赭石(TAA)、或乳白(TGA)终止密码子。18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子由核苷酸取代、缺失或插入而引入。19.如权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子选自：在变体X基因中对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上的位置9处开始的和/或对应于SEQIDNO:1所示的序列中的位置420的核苷酸位置处开始的终止密码子；在对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的位置13处开始的和/或对应于SEQIDNO:1所示的序列中的位置424的核苷酸位置处开始的终止密码子；在对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体X基因中的位置的3’方向上的位置17处开始的和/或对应于SEQIDNO:1所示的序列中的位置428的核苷酸位置处开始的终止密码子；在变体X基因中对应于野生型X蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上的位置21处开始的和/或对应于SEQIDNO:1所示的序列中的位置432的核苷酸位置处开始的终止密码子。20.如权利要求17-19中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子是琥珀(TAG)或乳白(TGA)终止密码子。21.如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的PRE包括包含SEQIDNO:28的变体X基因。22.如权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中：所述变体X基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸；和/或所述变体X基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。23.如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因还包含编码野生型肝炎病毒X基因中不存在的翻译后修饰信号的序列。24.一种多核苷酸，其包含修饰的转录后调节元件(PRE)，所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒X基因的变体，所述变体X基因包含编码不存在于所述野生型X基因中的翻译后修饰信号的序列。25.如权利要求23或权利要求24所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括泛素化位点。26.如权利要求23或权利要求24所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括：从位于所述变体X基因中对应于所述X蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向上2、3、4、5或6个核苷酸以内或至少2、3、4、5或6个核苷酸以内的位置处开始的第一密码子，其中所述第一密码子根据N端规则编码甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、或亮氨酸残基；和任选的从所述变体X基因中对应于所述X蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向上2、3、4、5或6个核苷酸以内或至少2、3、4、5或6个核苷酸以内的位置处开始的第二密码子，其中所述第二密码子根据N端规则编码谷氨酸或天冬酰胺残基。27.如权利要求23或权利要求24所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括一个或多个PEST序列。28.如权利要求24-27中任一项所述的多核苷酸，还包含编码与所述修饰的PRE可操作地连接的重组蛋白的核酸。29.如权利要求24-28中任一项所述的多核苷酸，其中：所述包含编码翻译后修饰信号的序列的变体X基因含有对应于SEQIDNO:1的核苷酸残基448-470的β茎环；和/或所述包含编码翻译后修饰信号的序列的变体X基因不含对应于SEQIDNO:1的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸变化。30.如权利要求24-29中任一项所述的多核苷酸，其中：所述变体X基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸；和/或所述变体X基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。31.如权利要求1-30中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因是野生型哺乳动物肝炎X基因的变体。32.如权利要求31所述的多核苷酸，其中所述野生型哺乳动物肝炎X基因是野生型土拨鼠肝炎病毒(WHV)X基因。33.如权利要求32所述的多核苷酸，其中所述野生型WHVX基因包括SEQIDNO:1和12-20中任一个的核苷酸411-592所示的核苷酸序列。34.如权利要求32或权利要求33所述的多核苷酸，其中所述野生型WHVX基因包括SEQIDNO:9的核苷酸序列。35.如权利要求1-34中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒PRE的至少两个或至少三个顺式作用的转录后调控子元件或其功能变体。36.如权利要求35所述的多核苷酸，其中所述至少两个或至少三个子元件包含野生型PREα子元件或其功能变体，野生型PREβ子元件的功能变体，和/或野生型PREγ子元件或其功能变体。37.如权利要求1-36中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的PRE包含野生型肝炎病毒PRE的α子元件或其功能变体和野生型PREβ子元件的功能变体。38.如权利要求36或权利要求37所述的多核苷酸，其中所述α子元件包含SEQIDNO:3的序列或其变体，所述β子元件包含SEQIDNO:6的序列的变体，和/或所述γ子元件包含SEQIDNO:8的序列或其变体。39.如权利要求1-38中任一项所述的多核苷酸，其中与野生型或未修饰的肝炎病毒PRE相比，所述修饰的PRE包含核苷酸修饰，所述野生型或未修饰的肝炎病毒PRE是哺乳动物肝炎PRE。40.如权利要求39所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒PRE包含SEQIDNO：1和12-27中任一个所示的核苷酸序列。41.如权利要求39或权利要求40所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎PRE是野生型土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。42.如权利要求39-41中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎PRE包含：a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或显示与SEQIDNO:1至少94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列相同性的核苷酸序列；或b)a)的核苷酸序列的部分，其中所述部分显示转录后活性。43.如权利要求39-42中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒PRE包含SEQIDNO：1和12-20中任一个所示的核苷酸序列。44.如权利要求39-43中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒PRE包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。45.如权利要求39-42中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎PRE包含：a)SEQIDNO:125所示的核苷酸序列或显示与SEQIDNO:125至少94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列相同性的核苷酸序列；或b)a)的核苷酸序列的部分，其中所述部分显示转录后活性。46.如权利要求45所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒PRE包含SEQIDNO:125的核苷酸序列。47.如权利要求1-46中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因包含起始密码子，所述起始密码子从对应于SEQIDNO：1的位置411的位置处开始。48.如权利要求47所述的多核苷酸，其中所述起始密码子是ATG起始密码子。49.如权利要求1-48中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体X基因还包含与所述变体X基因可操作地连接的启动子。50.如权利要求49所述的多核苷酸，其中所述启动子是包含SEQIDNO：11所示序列或野生型WHVX基因启动子序列的野生型X基因启动子。51.如权利要求1-23和31-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的PRE选自：a)包含显示与SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·U·塔林，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US