通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法技术

一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。

By increasing the scopoletin content, increasing soybean rust resistance in transgenic plants

A method for enhancing plant resistance to fungi, plants or plant cells, wherein the method comprises the following steps: compared with wild type plants and wild type plants or wild type plants, plant cells, increase parts of plants or plant cells of scopoletin and / or its derivatives and / or accumulation.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法专利技术简述本专利技术涉及一种增加植物、植物部分和/或植物细胞中针对真菌性病原体、尤其大豆锈菌和/或禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和/或轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)的抗性的方法。这通过增加植物、植物部分和/或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的含量、尤其通过增加F6H1表达来实现。这也可以通过施加含有莨菪亭和/或其衍生物的制剂或溶液来实现。另外，本专利技术涉及重组表达载体构建体，所述重组表达载体构建体包含与编码F6H1蛋白的序列相同或同源的序列。专利技术背景农业作物植物栽培主要地起到为人类和动物产生食品原料的作用。尤其，作为现今规则的单作高度易受流行样疾病传播影响。结果是产量明显减少。迄今，已经主要通过使用农药控制致病生物。如今，人类也有可能开始直接修饰植物或病原体的基因组成。备选地，可以合成真菌性感染后植物产生的天然存在的杀真菌剂并施加至植物。抗性总体上描述了植物防止或至少削弱遭受有害病原体侵染和定植的能力。可以识别天然存在抗性的不同机理，借助这些机理，植物抵抗植物病原性生物定植(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie,SpringerVerlag,Berlin-Heidelberg,德国)。就小种特异性抗性，也称作宿主抗性，在相容性和不相容性相互作用之间作出区分。在相容性相互作用中，强毒性病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体存活，并且可以建立繁殖结构，而宿主在发育方面严重受阻或死亡。在另一方面，当病原体感染植物但是在症状轻微形成之前或之后其生长受抑制(大多因为存在NBS-LRR家族的R基因所致，参见下文)时，不相容性相互作用发生。在后一种情况下，植物抵抗相应的病原体(Schopfer和Brennicke，参见上文)。然而，这种类型抗性对某种菌株或病原体最具特异性。在相容性和不相容性相互作用中，宿主对病原体的防御性和特异性反应发生。然而，在自然界，这种抗性经常因病原体的新型毒力小种快速进化形成而克服(Neu等人(2003)AmericanCytopathol.Society,MPMI16No.7:626-633)。大部分病原体具有植物物种特异性。这意味着病原体可以在某些植物物种中引起疾病，但是在其他植物物种中不引起疾病(Heath(2002)Can.J.PlantPathol.24:259-264)。某些植物物种中针对病原体的抗性称作非宿主抗性。非宿主抗性提供了免于植物病原体影响的强大、广谱和永久性保护。提供非宿主抗性的基因提供了对抗非宿主植物中某些疾病的强大、广谱和永久性保护的机会。尤其，这种抗性对不同的病原体株系起作用。真菌在全球分布。迄今已知大约100,000种不同的真菌物种。其中锈菌类特别重要。它们可以具有至多五个不同孢子阶段(不动精子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)的复杂发育周期。在致病真菌感染植物期间，通常观察到不同阶段。植物病原真菌和其潜在宿主植物之间相互作用的第一阶段对植物被真菌定植而言具有决定意义。在感染的第一阶段期间，孢子与植物的表面接合，萌发并且真菌穿入植物。真菌可以借助现存孔如气孔、皮孔、排水器和伤口穿入植物，或另外，它们因机械力的结果和借助消化细胞壁的酶直接穿入植物表皮。用于穿入植物的特定感染结构物形成。为了对抗，植物已经形成物理屏障，如蜡层，和具有抗真菌作用的化学化合物，以抑制孢子萌发、菌丝生长或穿透。大豆锈菌豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)直接穿透植物表皮。在穿过表皮细胞后，真菌到达叶肉的胞间隙，在这里真菌开始扩散遍及整个叶。为了获得养分，真菌穿入叶肉细胞并在叶肉细胞内部形成吸器。在穿入过程期间，被穿透的叶肉细胞的细胞膜保持完整。镰刀菌属(Fusarium)物种是攻击广泛类型植物物种(包括许多重要作物如玉米和小麦)的重要植物病原体。它们造成种子腐病、苗枯病以及根腐病、茎腐病和穂腐病。镰刀菌属病原体通过感染种子、根或穗丝感染植物或它们通过伤口或天然开口和裂口穿透植物。在非常短的建立阶段后，镰刀菌属真菌开始分泌霉菌毒素如单端孢霉烯、玉米赤霉烯酮和镰孢菌酸至感染的宿主组织中，导致细胞死亡和感染的组织浸软。从死亡组织获得营养，真菌随后开始通过感染的植物扩散，造成严重产量损失和所收获籽粒的品质下降。活体营养型植物病原真菌依赖植物活细胞的代谢取得它们的营养。这种类型的真菌属于活体营养型真菌类，如许多锈真菌、白粉病真菌或卵菌病原体如疫霉属(Phytophthora)或霜霉属(Peronospora)。坏死营养型植物病原真菌依赖植物的死细胞取得其营养，例如来自镰刀菌属、丝核菌属(Rhizoctonia)或球腔菌属(Mycospaerella)的物种。大豆锈菌占据居间位置，因为它直接穿透表皮，因此被穿透的细胞变得坏死。在穿透后，真菌变成专性活体营养型生活方式。基本上沿用这种感染策略的活体营养型真菌性病原体的亚类是半坏死营养型病原体。莨菪亭和莨菪苷是在遭受各种病原体如真菌或细菌感染时或响应于昆虫采食损伤、机械损伤、脱水或多种其他非生物胁迫在不同植物中积累的抗微生物酚类羟香豆素。莨菪亭显示广谱抗微生物活性并且可以在体外抑制各种真菌或细菌的发育和生长(Goy,P.A.,Signer,H.,Reist,R.,Aichholz,R.,Blum,W.,Schmidt,E.和Kessmann,H.(1993)AccumulationofscopoletinisassociatedwiththehighdiseaseresistanceofthehybridNicotianaglutinosaxNicotianadebneyi.Planta41:200–206.；Tal,B.和Robeson,D.J.(1986b).TheMetabolismofSunflowerPhytoalexinsAyapinandScopoletin:Plant-FungusInteractions.PlantPhysiology82:167–172)。莨菪亭和其葡糖苷莨菪苷源自类苯基丙烷途径(图1；(Kai,K.,Mizutani,M.,Kawamura,N.,Yamamoto,R.,Tamai,M.,Yamaguchi,H.,Sakata,K.和Shimizu,B.(2008).Scopoletinisbiosynthesizedviaortho-hydroxylationofferuloylCoAbya2-oxoglutarate-dependentdioxygenaseinArabidopsisthaliana.PlantJournal55:989–99)。莨菪亭/莨菪苷合成的关键步骤包括阿魏酰-CoA邻羟化、侧链的反/顺异构化、内酰化和–考虑莨菪苷合成时-糖基化(Kai等人,2008)。在拟南芥中，最近已经显示，莨菪亭产生取决于借助Fe(II)-和2-酮戊二酸依赖性双加氧酶F6H1(At3g13610)的阿魏酰-CoA邻羟化。发现侧链E-Z异构化和内酰化自发地进行。(Kai等人,2008)。在植物中，积累的莨菪亭最终可以糖基化以产生莨菪苷。已本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.04 EP 15153820.41.一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。2.根据权利要求1所述的方法，其中莨菪亭的衍生物是莨菪苷。3.用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法或根据权利要求1或2所述的方法，其中方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中F6H1蛋白的表达和/或生物学活性，其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:1、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；(ii)编码与SEQIDNO:2或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸，4.根据权利要求3所述的方法，其中方法还包括与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的至少一种或更多种额外蛋白质的表达和/或生物学活性，(a)其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:3、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；(ii)编码与SEQIDNO:4或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)外源核酸，编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT1蛋白相同的CCoAOMT1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同，(b)其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:5、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；(ii)编码与SEQIDNO:6或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸，并且(c)其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:7、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；(ii)编码与SEQIDNO:8或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的UGT71C1蛋白相同的UGT71C1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸。5.根据权利要求4所述的方法，包括步骤：(a)用包含外源核酸的表达盒稳定转化植物细胞，所述外源核酸编码F6H1蛋白并任选地编码选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外的蛋白质，(b)从植物细胞再生出植物；并且(c)表达所述外源核酸。其中编码F6H1蛋白的外源核酸和编码选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外的蛋白质的外源核酸位于相同的表达盒或不同的表达盒上。6.重组载体构建体，包含选自以下的一种或多种核酸：(a)编码F6H1蛋白的核酸，其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:1、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:2或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，与启动子和转录终止序列有效连接，(b)编码CCoAOMT1蛋白的核酸，其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:3、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:4或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT1蛋白相同的CCoAOMT1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，与启动子和转录终止序列有效连接，(c)编码ABCG37蛋白的核酸，其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:5、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:6或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(IN)的核酸不同的核酸；与启动子和转录终止序列有效连接；和(d)编码UGT71C1蛋白的核酸，其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:7、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:8或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的UGT71C1蛋白相同的UGT71C1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，与启动子和转录终止序列有效连接。7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其中启动子是组成型、病原体诱导型启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。8.转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，用根据权利要求6或7所述的一种或多种重组载体构建体转化，其中编码F6H1蛋白、CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白的核酸位于相同的重组载体构建体或不同的载体构建体上。9.转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，过量表达任选地与选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外蛋白质组合的外源F6H1蛋白，(a)其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:1、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:2或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，与启动子和转录终止序列有效连接，(b)其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:3、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；(ii)编码与SEQIDNO:4或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT1蛋白相同的CCoAOMT1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，与启动子和转录终止序列有效连接，(c)其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码(i)与SEQIDNO:5、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·舒尔塞斯，U·康拉特，C·朗根巴赫，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE