糖基化溶酶体蛋白、生产方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种溶酶体蛋白组合物，其包含根据糖基化模式潜在地多样化糖基化的多种溶酶体蛋白，其中所述糖基化模式具有至少45％的少甘露糖苷N‑聚糖；在苔藓植物或细胞中制备溶酶体蛋白组合物的方法，以及溶酶体蛋白组合物的医学和非医学用途。例如，溶酶体蛋白可以是用于治疗法布里病的α‑半乳糖苷酶或用于治疗戈谢病的β‑葡糖神经酰胺酶。独特的糖基化导致改善的治疗功效‑令人惊讶地甚至没有对于CHO细胞产生的溶酶体蛋白是常见的甘露糖‑6‑磷酸。

Glycosylated lysosome proteins, production methods and uses

The invention relates to a composition comprising a lysosomal protein, according to glycosylation patterns potentially diverse glycosylation of various lysosomal protein glycation pattern, which has the advantages of at least 45% less mannan N chitosan; preparation of lysosomal protein composition in bryophytes or cells, and lysosomal protein composition medical and non-medical purposes. For example, can be used for lysosomal protein alpha galactosidase treatment of Fabri's disease or for beta Glucosylceramidase treatment of Gaucher disease. Unique glycosylation resulted in improved therapeutic efficacy surprisingly did not even for CHO cells of the lysosomal protein is a common mannose 6 phosphate.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖基化溶酶体蛋白、生产方法和用途本专利技术涉及植物中重组蛋白表达的领域，用于获得与哺乳动物表达系统相比的修饰糖基化。背景溶酶体贮积病(LSD)是一组危及生命的遗传性病症；大多数是由单一溶酶体酶或蛋白的缺乏引起的，这导致细胞中底物异常积累。目前，酶替代疗法(ERT)是几种LSD唯一可用的具体治疗。在这些疾病中，通过静脉内输注缺失的酶，可以在许多靶组织中清除溶酶体贮积。传统上，在培养的哺乳动物细胞中产生用于ERT的重组酶。例如，US6083725描述了来自人细胞的α-半乳糖苷酶。最近，作为替代方法，已经利用基于植物的表达系统来生产用于治疗用途的溶酶体酶(Shaaltieletal.(2007)PlantBiotechnolJ5:579-590;Duetal.(2008)JLipidRes49:1646-1657;DeMarchisetal.(2011)PlantBiotechnolJ9:1061-1073;Heetal.(2012)NatCommun3:1062)。相对于基于哺乳动物细胞的系统，基于植物的系统具有若干优点，包括降低生产成本，消除被哺乳动物病原体污染的风险，和在藓类的情况下，相对更容易地操作N-糖基化途径。然而，用于ERT的植物细胞产生的酶的主要问题是它们与哺乳动物细胞产生的酶不同的N-聚糖结构。特别地，在植物细胞中表达的溶酶体酶在没有进一步的人工磷酸化的情况下，通常不会在末端甘露糖残基上获得甘露糖-6-磷酸(M6P)修饰。糖链在ERT中发挥关键作用。静脉内给予的溶酶体酶通过识别酶的糖结构的细胞表面受体被组织摄取。M6P受体(M6PR)和甘露糖受体(MR)代表了该摄取系统的两个主要贡献者。大多数溶酶体酶携带M6P残基。通常认为，在用于大多数LSD的ERT中，M6PR介导的内吞途径对于足够的酶递送是至关重要的(Slyetal.(2006)ProcNatlAcadSciUSA103:15172-15177;Sandsetal.(2001)JBiolChem276:43160-43165)。相反，MR存在于巨噬细胞上，认为其仅促进这些细胞中旨在酶替代的ERT的治疗效果。WO02/08404和WO2012/098537描述了烟草中各种溶酶体酶的产生。WO03/073839描述了植物种子中溶酶体酶的产生，特别是在烟草植物的种子中。US7011831描述了在昆虫细胞中产生具有复合N-聚糖糖基化的溶酶体酶。WO2008/132743描述了使用具有ER信号肽和液泡靶向信号的表达构建体在烟草中生产高甘露糖糖基化的溶酶体酶。EP2789686A1描述了植物糖基化途径的修饰以产生哺乳动物型磷酸化聚糖。US2006/040353描述了将β-半乳糖转移到N-连接的聚糖上。提出具有甘露糖-6-磷酸的糖蛋白用于治疗溶酶体疾病。Chiba等人从酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)产生人α-galA(Chibaetal.(2002)Glycobiology12:821-828)。在这种情况下，M6P被末端甘露糖覆盖，并且通过细菌α-甘露糖苷酶去除甘露糖残基导致培养的成纤维细胞中酶的M6PR依赖性摄取改善。最近，在另一个基因操纵的酵母菌株中表达了α-galA，该菌株过表达了MNN4，一种甘露糖基磷酸转移酶的正调节子(Tsukimuraetal.(2012)MolMed18:76-82)。该α-galA制备物中磷酸化的N-聚糖含量高于半乳糖苷酶α(agalsidasealfa)(28.7％对15.3％)。将这种酶重复注射到法布里小鼠中导致心脏和肾脏Gb3与注射半乳糖苷酶α的小鼠相似的降低。最近，Kizhner等人报道了从烟草细胞培养物产生的人α-galA的纯化和表征(Kizhneretal.(2015)MolGenetMetab114(2):259–267)。作为其它植物制造的溶酶体酶，该aGal是非磷酸化的。然而，该蛋白是化学交联和PEG化的。这些修饰与蛋白特征的显著变化相关，包括与半乳糖苷酶α或β相比，增加的体外稳定性和显著延长的循环半衰期(约10小时)。该酶的摄取机制仍有待阐明。然而，显著缓慢的血浆清除表明摄取不是通过M6PR或MR介导的内吞作用。US6887696描述了在高等植物烟草植物中表达两种溶酶体蛋白即α-葡糖脑苷脂酶和α-半乳糖苷酶的方法。烟草产生的溶酶体蛋白具有多样化的糖基化模式，具有大量复合N-聚糖，特别是GnMXF、MGnXF、GnGnXF、GnMx和MGnX。本专利技术的目的是提供用于生产溶酶体蛋白的替代来源，所述溶酶体蛋白作为用于治疗需要合适糖基化的溶酶体贮积病的治疗剂是有活性的。
技术实现思路
本专利技术的目的通过本专利技术来解决，其基于令人惊讶的发现：i)溶酶体蛋白上的少甘露糖苷(paucimannosidic)糖基化赋予了治疗选项的适用性，以及ii)在苔藓植物表达系统中可以容易地获得这样的少甘露糖苷糖基化。本专利技术提供一种制备溶酶体蛋白组合物的方法，包括在苔藓植物或细胞中表达编码溶酶体蛋白的转基因，其中所述溶酶体蛋白用N末端分泌信号表达，其中任选地在细胞内加工期间除去所述分泌信号，特别是其中溶酶体蛋白缺乏具有序列VDTM(SEQIDNO：1)的C-末端液泡信号，和所述方法还包括从所述植物或细胞获得表达的溶酶体蛋白。本专利技术还提供可通过本专利技术的方法获得的溶酶体蛋白组合物。本专利技术还提供一种溶酶体蛋白组合物，其包含根据糖基化模式潜在地多样化糖基化的多种溶酶体蛋白，其中所述糖基化模式具有至少45％的少甘露糖苷N-聚糖(摩尔％)。这样的蛋白组合物可以通过本专利技术的方法获得。还提供了一种加工包含复合N-聚糖的溶酶体蛋白的方法，所述方法包括在样品中提供溶酶体蛋白，并将样品与苔藓植物HEXO酶、优选HEXO3酶接触，由此苔藓植物HEXO酶切割来自溶酶体蛋白的末端GlcNAc残基，从而产生少甘露糖苷N-聚糖。HEXO酶可以在细胞中，特别是植物细胞中。溶酶体蛋白可以作为药物或在药物组合物中提供。本专利技术还提供了适于进行本专利技术方法的苔藓植物细胞或植物，其包含所述编码溶酶体蛋白的转基因。本专利技术还涉及一种治疗溶酶体贮积病的方法，包括将本专利技术的溶酶体蛋白组合物给予需要治疗的患者。所有这些方面是相互关联的，同样地形成本文呈现的整个专利技术的一部分，并且任何组合的本专利技术的优选实施例可以涉及这些方面中的任何一个，例如，在产生根据本专利技术待糖基化的任何溶酶体蛋白中，可以提供或使用通过给定构建体或方法转化的植物或细胞。关于任何实施方案或优选特征的以下详细描述同样涉及所有方面。例如，溶酶体蛋白的产物特征意味着选择该方法以产生具有其产物特征的该溶酶体蛋白。特定方法步骤的描述同样描述了通过该方法步骤修饰的蛋白。转化本专利技术的细胞以促进任何本专利技术的细胞中制备方法。所有溶酶体蛋白可用于本专利技术的使用溶酶体蛋白的(治疗或非治疗)方法。本专利技术在权利要求书中进一步定义。具体实施方式溶酶体贮积病(LSD)是一组由溶酶体功能缺陷引起的约50种罕见遗传性代谢病症。溶酶体负责消化包括几种关键酶的各种分子。如果这些酶之一由于突变而有缺陷，则大分子积聚在细胞内，最终杀死细胞。溶酶体贮积病症是由溶酶体功能障碍引起的，通常是脂质、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单一酶缺乏的结果。溶酶体贮积病的治本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备溶酶体蛋白组合物的方法，包括在苔藓植物或细胞中表达编码溶酶体蛋白的转基因，其中所述溶酶体蛋白用N末端分泌信号表达，其中在细胞内加工期间任选地除去所述分泌信号，并且所述方法还包括从所述植物或细胞获得表达的溶酶体蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.17 EP 15159443.91.一种制备溶酶体蛋白组合物的方法，包括在苔藓植物或细胞中表达编码溶酶体蛋白的转基因，其中所述溶酶体蛋白用N末端分泌信号表达，其中在细胞内加工期间任选地除去所述分泌信号，并且所述方法还包括从所述植物或细胞获得表达的溶酶体蛋白。2.权利要求1的方法，其中表达的溶酶体蛋白是从植物或细胞的分泌物质获得的，优选不破坏生产细胞或植物。3.权利要求1或2的方法，其中溶酶体蛋白缺乏具有序列VDTM(SEQIDNO：1)的C-末端液泡信号和/或缺乏具有序列KDEL(SEQIDNO：2)的C末端ER滞留信号。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中溶酶体蛋白缺乏任何C末端ER滞留信号序列和/或缺乏任何C末端液泡信号序列。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中溶酶体蛋白包含在C末端以天然溶酶体蛋白或其截短的氨基酸终止的表达氨基酸序列。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中苔藓植物或细胞是藓类优选小立碗藓(P.patens)植物或细胞，和/或其中苔藓植物或细胞已经抑制或消除α1,3-岩藻糖基转移酶和/或β1,2-木糖基转移酶。7.可通过权利要求1至6中任一项的方法获得的溶酶体蛋白组合物。8.一种溶酶体蛋白组合物，其包含根据糖基化模式潜在地多样化糖基化的多种溶酶体蛋白，其中所述糖基化模式具有至少45％的少甘露糖苷N-聚糖(摩尔％)。9.权利要求7或8的溶酶体蛋白组合物，其中溶酶体蛋白是选自以下的任何一种：α-半乳糖苷酶，优选α-半乳糖苷酶A(GLA)；β-葡糖神经酰胺酶，β-葡糖苷酶(葡糖脑苷脂酶)；α-甘露糖苷酶；天冬氨酰葡糖胺酶；β-甘露糖苷酶；酸性神经酰胺酶；α-岩藻糖苷酶；β-半乳糖苷酶，β-己糖胺酶激活物蛋白；半乳糖脑苷脂酶，半乳糖神经酰胺酶；溶酶体酸性脂肪酶(LAL)；α-艾杜糖苷酸酶；艾杜糖苷酸-2-硫酸酯酶；葡糖胺-N-硫酸酯酶，硫酸乙酰肝素硫酸胺酶(SGSH)；α-N-乙酰葡糖胺酶(NAGLU)；α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶；N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶；β-半乳糖苷酶；N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶；β-葡糖苷酸酶；神经氨酸酶；鞘磷脂酶，鞘磷脂磷酸二酯酶；酸性α-1,4-葡糖苷酶；β-己糖胺酶或其α亚基；α-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)，α-半乳糖胺酶；β-己糖胺酶A；半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶；透明质酸酶。10.权利要求7至9中任一项的溶酶体蛋白组合物，其中溶酶体蛋白具有一个或多个包含式1结构的少甘露糖苷N-聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：P达布洛斯卡施勒普，F本贾明，A布希，H尼伊德克雷格，A沙亚夫，
申请(专利权)人：格林诺瓦森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE