本发明专利技术涉及在具有细胞壁的细胞中生产重组蛋白的方法，所述方法包括在培养基中通过将蛋白表达在所述细胞中，增加所述重组蛋白穿过细胞壁的分泌的步骤，所述培养基含有表面活性聚合物和单价金属离子的组合且具有至少0.32osmol/L的渗量，所述发明专利技术进一步涉及用于所述方法的培养基和营养物混合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 本专利技术涉及通过使用合适的表达方法优化真菌或植物的重组表达系统。[000引 已经在许多出版物中描述了在植物中生产在ng/1至帖/1的浓度范围内的重组蛋 白。国际公开WO 01/25456 A2涉及一种在不裂解苔薛类植物（Moosen)组织或苔薛类植物 细胞的情况下生产在苔薛类植物中的蛋白的方法。此外提及，在培养基中使用PVP可W增 加生产力。作为例子，展示了VEGF^i (-种具有28 kDa的大小的小糖基化的同源二聚体） 的重组生产炬aur等人，Journal of Biotechnology 119 (2005): 332-342)。Baur等人 描述了使用PEG对苔薛类植物的瞬时转化。用于生产VEGF的培养基不含有PVP或PEG。Drake等人，Plant Mol. Biol. 52 (2003) : 233-241描述了在烟草植物组 织（即根）的培养物中抗体的重组表达。通过根分泌的过程分泌在微克沁g)范围内的抗 体。基于根分泌的有效植物表达系统主要是毛状根培养物，其可W通过用发根±壤杆菌 知rAizwenes)感染任意植物来刺激（Gaume等人，Plant Cell Rep. 21 (2003): 1188-1193)。Komarnysky等人，Plant Physiology 124 (2000) : 927-933描述了通过吐水过 程分泌重组蛋白，其中随叶子的吐水液体分泌出蛋白。每天的生产率在1嗦/g叶质量的范 围内。在Kwon等人，Biotechnology and Bioengineering 81 (7) (2003) : 870-875中 描述了用于重组表达异源蛋白的烟草息浮培养物。将经转化的植物的愈伤组织细胞用作用 于生产人IL-12的细胞系。作为细胞培养基的添加剂，对3种聚合物稳定IL-12的性能进 行了测试。PVP和PEG不具有作用。明胶导致IL-12的稳定化，直至第5天起培养基中的蛋 白酶导致浓度降低。在Lee等人，Journal of Biotechnology 96 (2002): 205-211中描 述了类似的结果。LaCount等人，Biotechnology Letters 19 (1) (1997) : 93-96描述了通过用PVP 处理W保护免于蛋白酶降解来稳定化重组生产的抗体和GM-CSF。 Lee和Kim, Biotechnology Letters 24 (2002) : 1779-1783描述了Pluronic F-68和聚己二醇用于保护烟草息浮培养物中的细胞免受揽拌罐生物反应器中的机械损伤 的用途。Magnuson等人，Protein Expression and化rification 7, (1996) : 220-228描 述了在烟草细胞的息浮培养物中表达单克隆抗体的50 kDa重链。通过向培养基中添加PVP 使收率增加35倍。该归因于蛋白的稳定化W及阻止了在容器壁上的聚集和积累。66%的蛋 白存在于细胞质中，30%存在于膜级分中，且仅4%存在于培养基中。尽管存在分泌信号序 列(其仅发送穿过细胞膜的信号)，但是认为具有大于50 kDa的摩尔质量的大蛋白过大，不 能穿过细胞壁。Schuster等人，Biotechnol. J. 2 (2002) : 1-9描述了在苔薛类植物原生质体 中生产抗体。增加与前述根据Baur等人的增强效率的转化相组合，在3M-和W5-培养基的 混合物中培养，使收率从0. 1- 0. 5嗦/ml增加至8. 2嗦/ml。 Tsoi和Doran, Biotechnol. Appl. Biochem. 35 (2002) : 171- 180描述了不 同的表达培养基和它们对烟草细胞息浮培养物的抗体表达的影响。分泌的抗体的收率在 20-200嗦/50ml培养基之间。 US2010/035327Al涉及培养基的通用添加剂，其由水稻多糖和多肤制成。据推测 其会提高细胞产物的生长和分泌。但是，其中没有提及通过细胞壁分泌的问题。 David等人，JournalofBiotechnology150 (1) (2010) : 115- 124 涉及在巨 大芽抱杆菌(公(即没有细胞具有细胞壁）中重组生产抗体片段。Baur等人，PlantBiotechnologyJournal3 (3) (2005) : 331- 340 描述了作 为表达系统的小立碗薛(只W及通过使用添加剂（PV巧和通过表达人血清白蛋白 增加的重组人生长因子（VEGF)的分泌。Decker等人，BioprocessandBiosystems!Engineering,Jan. 31 (1) (2008): 3-9-般地讨论了苔薛类植物生物反应器中的培养条件和植物特异性的糖工程。Twyman等人，TrendsinBiotechnology21 (12) (2003) : 570- 578 解释了植 物作为重组表达系统的用途。关于收率讨论了转染系统、信号序列和mRNA稳定性。 尽管已知可用于在异源蛋白的重组生产中增加植物和植物细胞的生产力的方法， 但是植物系统的生产力仍然始终低于动物细胞的，例如建立的Cffi)表达系统。因此，总是需 要进一步增加植物表达系统的生产力。此外，分泌型蛋白的生产是合乎需要的，由此不必破 坏生产细胞并且可W将其用于其它生产。 因此，本专利技术的一个目的是，提供改进的表达方法W及用于所述方法的试剂。 本专利技术涉及一种在具有细胞壁的细胞中生产重组蛋白的方法，所述方法包括下述 步骤；在培养基中通过在所述细胞中表达蛋白，分泌该重组蛋白穿过细胞壁，所述培养基含 有表面活性聚合物和单价金属离子的组合且具有至少0.22osmol/L的渗量。本专利技术的其 它方面是该种培养基W及材料组合物。具体地，所述分泌步骤是分泌的增加。所述增加通 常相较于未经处理的细胞。此外，本专利技术如在所附权利要求中所定义。在下文中描述了特 定实施方案和优选的参数，它们可W彼此组合地提供。 对于成功且廉价的生物药物的生产而言需要成功的蛋白分泌W及增加的产物量 虹径八至3/1]。此外，细胞壁由于它们的（大）分子结构会充当尺寸排阻过滤器。在植 物-或真菌细胞中生产重组蛋白时，该事实会阻止大于90kDa的产物分泌进培养基中，此 分泌对于进一步加工而言是有利的。相反，所生产的蛋白，如果它们具有分泌信号肤，尽管 被运输穿过细胞膜，但随后积累在质外体空间中，即在位于细胞膜和植物细胞壁的外边界 之间的隔室中。具有至少50kDa的较小蛋白的分泌也减少。本专利技术首先增加了蛋白的生 产量，并且此外W令人惊讶的方式促进了该蛋白的分泌。根据本专利技术生产的蛋白可W具有 任意大小。在较大蛋白的情况中产生特殊的优点。因此，根据本专利技术生产的蛋白优选大于 40kDa、大于 50kDa、大于 55kDa、大于 60kDa、大于 65kDa、大于 70kDa、大于 75kDa、大 于80kDa或大于85kDa、大于90kDa。所述蛋白也可W是该种蛋白的二聚体或异聚体。 所述单价金属离子优选地选自碱金属离子，诸如Li、化、K、化或Cs。特别优选地， 所述单价金属离子包含或是化离子。[002。 优选地，所述金属离子，例如化离子，W至少20ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
在具有细胞壁的细胞中生产重组蛋白的方法，所述方法包括在培养基中通过在所述细胞中表达蛋白，分泌所述重组蛋白穿过细胞壁的步骤，所述培养基含有表面活性聚合物和单价金属离子的组合且具有至少0.32 osmol/L的渗量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.17 EP 12164458.71. 在具有细胞壁的细胞中生产重组蛋白的方法，所述方法包括在培养基中通过在所述 细胞中表达蛋白，分泌所述重组蛋白穿过细胞壁的步骤，所述培养基含有表面活性聚合物 和单价金属离子的组合且具有至少0. 32osmol/L的渗量。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分泌从所述细胞的质外体空间向培 养基中进行。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞是植物细胞、在植物中或 在植物组织中的细胞、真菌细胞或在真菌中的细胞、或藻类细胞，特别优选是苔藓类植物细 胞。4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，在悬浮培养物中培养所述 细胞。5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其特征在于，所述金属离子是碱金属离 子，优选钠，和/或所述金属离子以至少20mM的浓度存在于所述培养基中。6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述表面活性聚合物是聚 烷基二醇，优选聚乙二醇，和/或所述表面活性聚合物以至少〇. 05重量％的浓度存在于所 述培养基中。7. 根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基包含：硝酸根离 子，优选以至少0.2mM的浓度，磷酸根离子，优选以至少0.05mM的浓度，硫酸根离子，优选 以至少0.02mM的浓度，钙离子，优选以至少0.1mM的浓度，钾离子，优选以至少0.1mM的 浓度，钠离子，优选以至少20mM的浓度，或它们的组合。8. 根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其特征在于，在所述的在所述培养基中 分泌所述重组蛋白的步骤之前，使所...
【专利技术属性】
技术研发人员：W乔斯特，M克纳彭伯格，D克劳斯尼特泽，A沙亚夫，
申请(专利权)人：格林诺瓦森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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