一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。培育方法为(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得；(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得；(3)转基因植株获得。重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白，必要时可包括增强子；基因ZFP181参与水稻的抗病应答反应，增强ZFP181的表达能提高水稻抗白叶枯病性。

【技术实现步骤摘要】
一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，在培育方法中使用的重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及以上载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。
技术介绍
A20/AN1锌指蛋白是一类具有A20或AN1锌指结构的蛋白，其广泛存在于真核生物中。已有研究结果表明，A20/AN1锌指蛋白在动物体中主要参与NF-κB介导的免疫反应，而在植物体中主要参与非生物胁迫响应。OSISAP1为植物中分离的第一个A20/AN1锌指蛋白基因。OSISAP1的表达受冷、脱水、盐、水浸没(低氧)、重金属、机械伤害等胁迫及胁迫激素ABA的诱导。过量表达OSISAP1可提高转基因烟草幼苗对盐、冷及干旱的耐受性(Mukhopadhyayetal.，2004)。随着基因组测序的深入开展，人们在水稻、拟南芥、杨树、玉米和番茄基因组中分别鉴定了18、14、19、11和13个A20/AN1型锌指蛋白(Huangetal.，2008；Jinetal.，2007；Solankeetal.，2009；VijandTyagi，2006)。进一步分析研究发现植物中大部分A20/AN1家族锌指蛋白基因的表达受一种或多种非生物胁迫诱导(Huangetal.，2008；Jinetal.，2007；Solankeetal.，2009；Stroheretal.，2009；VijandTyagi，2006)，可能参与了非生物胁迫响应(Solankeetal.，2009；VijandTyagi，2006)随着植物A20/AN1锌指蛋白家族基因的鉴定，关于该基因家族成员功能的鉴定也逐步展开。OsiSAP8受盐、干旱、脱水、冷、水浸没、伤害、重金属及ABA诱导。过量表达OsiSAP8能提高苗期烟草及水稻对盐，冷及干旱胁迫的耐受性。水稻ZFP177受冷及热胁迫诱导，过量表达ZFP177能提高转基因烟草幼苗对冷、热及氧化胁迫的耐受性，但导致转基因烟草幼苗对盐及干旱胁迫敏感。獐毛AlSAP受盐、冷、热胁迫及ABA、SA诱导，异源表达AlSAP能提高转基因酵母对渗透胁迫及离子胁迫的耐受性。过量表达AlSAP转基因烟草与野生型一样表现正常生长表型，同时能提高转基因烟草植株对冷、热、干旱及盐胁迫的耐受性。过量AlSAP转基因水稻表现与其转基因烟草相似结果，能提高其对冷、干旱及盐胁迫的耐受性。此外，AlSAP能提高转基因小麦的抗旱性及耐盐性(BenSaadetal.，2012a)。AtSAP12受冷及盐诱导，其重组蛋白四级结构随着氧化还原状态改变而改变，高浓度DTT和硫氧还蛋白TrxA，低浓度DTT，硫氧还蛋白与其依赖的NADPH均能降低氧化的AtSAP12聚合体，增加AtSAP12单体蛋白量。在盐及冷胁迫条件下，AtSAP12单体蛋白量显著降低，推测AtSAP12可能通过不同氧化还原状态下功能的改变而来参与非生物胁迫响应(Stroheretal.，2009)。AtSAP10表达受各种胁迫调节，包括金属及非金属离子(Cd、Zn、AsIII、AsIV，Ni和Mn)、ABA、热，盐和冷。AtSAP10能提高转基因拟南芥对高温、Zn、Mn和Ni胁迫耐受性(DixitandDhankher，2011)。以上研究表明A20/AN1型锌指蛋白在植物抗逆应答反应中发挥了重要的作用，然而该类基因在植物抗病应答反应中的研究还罕见报道。
技术实现思路
针对目前A20/AN1型锌指蛋白类基因在植物抗病应答反应中研究的空白，公开水稻A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病基因工程中的应用，过量表达该基因可以提高植物的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。本专利技术的目的具体通过以下技术手段获得：1.本专利技术提供一种重组载体，该载体包括序列如SEQIDNO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA链接酶将基因ZFP181连接到载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白。所述表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等，该表达载体以任何一种启动子启动表达，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。2.本专利技术还提供包括上述1重组载体的转化细胞。3.本专利技术提供一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，该方法包括如下步骤：(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得选用水稻粳稻品种韭菜青，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA，参照Ferments公司反转录系统合成韭菜青cDNA第一链；设计基因克隆引物上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP181基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP181基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP181；(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得根据ZFP181基因序列，以步骤(1)中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板，设计引物对，通过PCR扩增ZFP181基因全长；利用NcoI与BstPI将ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；(3)转基因植株获得将获得的重组载体pCAMBIA1304-ZFP181转化农杆菌EHA105；以水稻粳稻品种“中花11”为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。4.权利要求3所述的锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，其特征在于：步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得过程中使用的引物对，上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′；步骤(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得过程中，设计的引物对为ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′；ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTCAGGTTG-3′。5.转锌指蛋白基因ZFP181水稻的鉴定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤(1)设计转基因检测引物对：LacZ-F：5′-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3′，181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′，对提取的转基因水稻DNA进行PCR检测，能够扩增出1313bpDNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；从而确定ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；(2)设计ZFP181基因特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体，其特征在于：该载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白ZFP181。

【技术特征摘要】
1.序列如SEQIDNO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病水稻育种上的应用，其特征在于：增强所述的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181的表达，能够提高水稻的抗白叶枯病性。2.一种重组载体在抗白叶枯病水稻育种上的应用，其特征在于：所述的重组载体包括序列如SEQIDNO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白ZFP181。3.一种转化细胞在抗白叶枯病水稻育种上的应用，其特征在于：所述的转化细胞包括有重组载体，所述的重组载体包括序列如SEQIDNO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白ZFP181。4.锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法在抗白叶枯病转基因水稻育种上的应用，其特征在于：所述的培育方法包括如下步骤：（1）重组质粒pMD18T-ZFP181的获得选用水稻粳稻品种韭菜青，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA，参照Ferments公司反转录系统合成韭菜青cDNA第一链；设计基因克隆引物，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增序列如SEQIDNO.1所示的ZFP181基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP181基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP181；（2）重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得根据ZFP181基因序列，以步骤（1）中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板，设计引物对，通过PCR扩增ZFP181基因全长；利用NcoⅠ与BstPⅠ将ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；（3）转基因植株获得将获得的重组载体pCAMBIA1304-ZFP181转化农杆菌EHA105；以水稻粳稻品种中花11为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（1）重组质粒pMD18T-ZFP181的获得过程中使用的引物对，上游引物ZFP181F：5'-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄骥，张红生，蓝虹霞，鲍永美，王州飞，唐海娟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32