用于瞬时转染完整植物的农杆菌制造技术

一种瞬时转染植物或植物上的叶的方法，包括使所述植物或所述叶与包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于瞬时转染完整植物的农杆菌 专利
本专利技术涉及瞬时转染植物或植物上的叶的方法。本专利技术还涉及在植物中或在植物 上的叶中瞬时表达目的DNA序列的方法。另外，本专利技术涉及农杆菌（Agrobacterium)菌株。 专利技术背景 用于农业的当前基因工程方法均基于1983年首次阐明（Fraley等人1983 ; Barton等人1983)并自1996年商业化的作物物种的稳定基因修饰。尽管基于植物稳定遗 传转化的农业方法如今是现实并且是成功新实践的基础，但它具有多种限制，主要限制是 开发转基因作物所需的时间很长和成本高昂。参与植物生物技术的公司之间的一般共识是 取决于作物物种，研发过程需要8 - 16年，并且平均开发总成本估计在一亿和一亿五千万 美元之间。因为这些限制，自从发现植物遗传转化方法以来超过25年后，仅少量性状和少 数GM作物物种迄今已商业化。 已知也可以使植物细胞和全株植物短暂再编程（即，没有新遗传物质稳定整合在 植物染色体上），并且瞬时方法例如病毒感染快捷。此类瞬时方法原则上可以允许非常快速 地调节植物代谢，有利于用户感兴趣的某些产物。此类方法要求已经被工程化以有效和安 全地转染植物的DNA或RNA载体（病毒或细菌）。早期尝试使用基于植物病毒的载体已经部 分获得成功，在于它们允许转染植物以制造高价值的重组蛋白质，例如某些生物药（Gleba 等人2007, 2008 ;Lico等人2008)。文献中已经描述利用病毒操纵其他性状例如输入性状 (例如除草剂抗性，Shiboleth等人2001 ;Zhang和Ghabiral 2006)，但病毒转染在感染的 宿主中引入如此多不想要的变化，从而不再继续寻求这类瞬时方法用于输入性状。瞬时方 法还可以围绕农杆菌（Agrobacterium)物种将其Ti质粒的部分转移给真核细胞（特别是 植物细胞）的能力进行构建。使用基于农杆菌的转染是用于遗传操纵例如遗传转化方案和 实验室瞬时转染试验的基础。基于农杆菌的转染的工业应用也局限于重组蛋白质制造，原 因是最佳应用条件（例如用细菌悬液对植物的真空渗入）不能在田间大规模使用，而用细 菌溶液喷洒地上部分或浇灌植物导致转染据推测非常小部分的植物细胞，并且先前研究根 本未解决这个具体问题。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌（A. rhizogenes)在世 界上广泛用于研究实验室中，用于植物的瞬时转染和稳定遗传转化。这些应用基于农杆菌 将遗传信息转移给真核细胞的能力。目前培养的许多转基因植物例如大豆、卡诺拉油菜和 棉，通过农杆菌介导的遗传转化产生。在瞬时转化和稳定转化之间的本质差异是：在稳定转 化的方法中,农杆菌递送的DNA最终整合到植物染色体中，并且随后由植物子代继承。此类 整合事件甚至在专门设计以提供植物细胞和细菌之间大量接触的实验室实验中是稀有的； 因此为了选择稳定转化体，不得不利用专用选择性筛选方法并且使用为最佳转化和再生成 完整植物而选择的特定植物外植体（富含分生组织）。因此，在这个科学领域积累的知识对 于对瞬时方法有兴趣的那些人而言价值有限，在瞬时方法中应影响植物体的许多细胞，但 不选择被转染的细胞。 另一方面，瞬时转染仅考虑农杆菌驱动的向植物细胞核递送DNA的早期步骤以及 下述事实：此类递送的DNA分子可以在胞核中转录，甚至在DNA不整合到植物染色体的情况 下，这种表达导致植物细胞的瞬时代谢性再编程。已经将这种再编程开发成用于快速评价 不同遗传实验的实验工具。尽管存在关于农杆菌介导向植物细胞转移DNA的大量知识，但 是这种信息总是限于实验室规模的实验，并且因而迄今为止，极少尝试开发涉及农杆菌作 为DNA载体的工业规模应用。 实验室应用的局限之一是：基于农杆菌的DNA递送要求难以或不可能在大田或大 规模应用的某些处理。在常见的瞬时实验中，将培养的植物细胞或植物部分（外植体）用 过量细菌处理，以提供最大程度的递送。在常见的研究实验中，人们还对如果按工业规模进 行则经济上不可行的表达水平感兴趣。一般而言，这个领域内进行的研究已使研究者引出 这样的结论：严重影响瞬时表达的参数是允许农杆菌与植物体内的植物细胞实现最佳相互 作用的那些参数。此类研究大多数利用真空渗入、注射入植物叶内或表面活性剂处理，弄创 植物表面（例如用刀片）、或其组合。事实上，正在开发不涉及（基于病毒）进一步扩增原 始DNA的用于商业生产重组蛋白质的基于农杆菌的转染方法的唯一团队是Medicago的团 队（D' Aoust等人2008, 2009 ;Vezina等人，2009)。他们的方法完全依赖于真空渗入作为 递送方法。然而，因为基于大大过量的细菌与植物细胞比，用于植物瞬时转染的当前实验室 方案不具有真正的转化价值，即，它们不能直接按工业水平重复。除了少数情况之外（例如 Vaquero等人，1999, D' Aoust等人，2008, 2009)，他们仍未定量地解决瞬时转染方法的效率 问题。（此类研究的例子是大量的，我们仅引用少数代表性例子：Li等人，1992 ;Liu等人， 1992 ;Clough 和 Bent，1998 ;De Buck 等人，1998, 2000 ;Chung 等人，2000 ;Yang 等人，2000 ; Zambre 等人，2003 ;Wroblewski 等人，2005 ;Lee 和 Yang，2006 ;Zhao 等人，2006 ;Shang 等 人，2007 Jones 等人，2009 ;Li 等人，2009 ;De Felippes 和 Weigel，2010)。 目前尚在开发中的工业方法之一是magnifection，一种基于农杆菌真空渗入植物 叶的方法。magnifection法（由Icon Genetics GmbH注册为magn丨CON_*_商标且由几 项专利/专利申请覆盖）是一种用于植物中异源蛋白质表达的简单和可无限放大规模的 方案，该方案避免植物的稳定遗传转化，而依赖于由农杆菌以DNA前体形式递送到植物体 的多个区域（全身性递送）的病毒载体瞬时扩增。这种方法实质上是用携带编码病毒RNA 复制子的T-DNA的农杆菌的稀释悬液渗入完整成熟植物。在这个方法中，细菌承担初始感 染和全身移动的（以前是病毒）功能，而病毒载体提供细胞至细胞的（短距离）传播、扩增 和高水平蛋白质表达。放大（工业）形式围绕完全装配的病毒载体（而不是要求在植物中 装配的前载体）建立并且要求通过真空渗入将农杆菌高通量递送至完整植物的装置。该方 法可以放大，但它要求植物的地上部分在真空下浸入细菌悬液内（该过程涉及颠倒盆中或 盘中培育的植物），这是一个在以下方面造成限制的流程：可以按这种方式处理的生物量 的体积、该方法的通量、在处理前可以培养植物的方式，并且它还带来一些成本，这些成本 将该方法的用途限于高成本产品，例如仅仅用于重组生物药。magnifection法是有效的， 因为它允许转染所处理植物中的几乎全部叶细胞、或约50%的总地上植物生物量（剩余部 分是莖和叶柄）。该方法已经以许多方式优化，参见例如Marillonnet等人，2005。然而， 当前方法完全围绕细菌递送方法构建，例如注射到植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
瞬时转染植物或植物上的叶的方法，包括使所述植物或所述叶与包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.03 EP 12002402.11. 瞬时转染植物或植物上的叶的方法，包括使所述植物或所述叶与包含农杆菌菌株 CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 质粒或所述vir质粒的衍生物。2. 在植物中瞬时表达目的DNA序列的方法，包括使所述植物或所述植物上的所述叶与 包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 质粒或所述vir质粒的衍生物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有双元载 体，所述双元载体具有包含待转染入所述植物或叶的细胞中的目的DNA序列的T-DNA。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有 卸甲vir质粒或卸甲Ti-质粒。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中菌株CryX的所述衍生菌株含有vir 质粒，所述vir质粒是菌株CryX的vir质粒的衍生物，并且所述衍生菌株实现T-DNA从含 有T-DNA的双元载体至植物细胞的转移效率是采用菌株CryX时的T-DNA转移效率的至少 70%。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中菌株CryX的vir质粒的所述衍生物 编码菌株CryX的virG蛋白。7. 根据权利要求6所述的方法，其中菌株CryX的vir质粒的所述衍生物含有菌株CryX 的vir质粒的vir区。8. 根据权利要求3所述的方法，其中所述双元载体包含在所述菌株CryX或所述衍生菌 株中可表达的virG基因。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述virG基因编码来自根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株 LBA4404 的 SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·勒默尔，L·波特西，D·泰德，A·吉里奇，Y·格莱巴，
申请(专利权)人：诺麦生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE