本发明专利技术公开了一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其包括根据RNase ZS1设计靶标序列的步骤；和构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体的步骤；和构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和获得转基因苗的步骤；和突变位点的鉴定步骤；以及获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。本发明专利技术的方法彻底的失活了RNase ZS1蛋白的活性，实现人工培育不带转基因成分的温敏不育系，同时与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，具有目的性强，基因组的损伤小，规避了转基因带来的可能风险。
【技术实现步骤摘要】
-种定点突变RNase Zs1
本专利技术涉及水稻温敏不育系的突变方法，具体涉及一种定点突变RNase Zsi获得温 敏不育系的方法。
技术介绍
水稻（Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以 水稻为主食（Miura et al.，2010)。随着人口的增长和可耕地面积的减少，粮食的供需变得 越来越不平衡（Gupta et al.，2006)，增加粮食单位面积广量已成为解决粮食供需不平衡 的关键措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规优质水稻提高20-30%的产量，在解决粮 食短缺的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻的种植面积逐年上升，现已超过水 稻种植面积的 60% (cheng et al.，2007 ;Normile, 2008 ;Su et al.，2012)。 根据所使用的不育系类型的不同，杂交水稻育种的方法主要分为两系法和三系法 (cheng et al.，2007)。三系法通过使用细胞质雄性不育系和恢复系产生杂种Fl代种子， 利用保持系和细胞质雄性不育系杂交保留细胞质雄性不育系（Wang et al.，2006 ;Fujii et al·，2009 ;Itabashi et al·，2011 ;Luo et al·，2013 ;Chen et al·，2014);但是只有少 数水稻品种可以作为恢复系，这大大降低了恢复系与不育系间的遗传多样性，限制了杂种 优势的利用（Zhang et al.，1994 ;Zhou et al.，2012 ;Zhang et al.，2013)。而两系法主 要利用光/温敏雄性核不育系来实现，因为光/温敏不育系育性受日长和温度调控，在不 育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。而且由于不受核质互作影 响，几乎所有的正常品种都可以作为恢复系（袁隆平，1994 ;Zhang et al.，1994 ;Ding et al.，2012a)。基于这个本质上的差异，两系法杂交技术具有更为广泛的恢复系，不需要特殊 的恢复基因，使得配组更加自由，利于亚种间杂种优势的利用，对提高杂交稻组合的产量、 米质、抗性等存在更大的潜在优势；不育系可一系两用，不需要保持系，简化了生产程序； 温敏不育受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传物质的多样性，可以避免三系杂 交稻不育细胞质的负效应和细胞质单一可能带来的潜在危险（王效宁等，2005 ;Yang et al·，2007;蔡春苗等，2008 ;Zhou et al·，2012 ;Zhang et al·，2013)。因此，温敏不育系在 杂交水稻育种中潜力巨大，相比而言，目前广泛应用的为温敏不育系。 安农S-I温敏不育水稻是第一个被发现的籼型温敏不育系（邓华凤等，1999)，温 敏不育材料往往通过自然突变获得，自然突变频率非常低，而用传统育种手段将自然突变 的温敏不育材料培育成为温敏不育系过程漫长，如何提高温敏不育系的培育效率已成为迫 切需要解决的问题。要突破传统育种的局限，必须使用基因工程手段。尽管，RNAi和反义 RNA技术可以实现对基因的抑制表达，但是并不能彻底删除基因的功能，基因残留的功能 会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且转基因植株中会残留外源序 列，涉及转基因安全问题。近年来，定点突变技术取得了突破性进展，比如ZFN(Zinc finger nucleases), TALEN(Transcriptionactivator-like effector nucleases)和 CRISPR/ Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)已广泛应用于各种生物中。这些方法都是通过靶识别序列或引导序列将核 酸酶引导到靶标位置，然后核酸酶切割靶标DNA，在细胞自身修复系统的作用下将切断的 DNA修复链接起来，但是在修复过程中往往会导致碱基丢失。目前，已经通过RNAi技术干 涉RNase ZS1，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是降低了 RNase Zsi的表达量，并不能彻 底的使其失活，使转基因植株有较高的不育起点温度，且不育起点温度不稳定，影响制种安 全。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种定点突变RNase Zsi获得温 敏不育系的方法，彻底的失活了 RNase Zsi蛋白的活性，实现人工培育不带转基因成分的温 敏不育系，同时与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，具有目的性强，基因 组的损伤小，规避了转基因带来的可能风险。 为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下： -种定点突变RNase Zsi，其包括 利用 CRISPR/Cas9 系统根据 RNase Zsi (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)设计靶 标序列的步骤；和 构建含靶标序列片段的pU3_gRNA载体的步骤；和 构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和 获得转基因苗的步骤；和 突变位点的鉴定步骤；以及 获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。 本专利技术所述靶标双链片段中的一条链具有以下结构：5' -NX-NGG_3'，也可以是 5' -Nx-NAG-3'或5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一个，14彡X彡30。较佳的靶 位点序列以A或G开头。本专利技术根据靶标的设计原则在RNase Zsi的编码区可以找到148 个 5' -Nx-NGG-3'，121 个 5' -Nx-NAG-3'，133 个 5' -Nx-NGA-3' 序列作为靶标。 上述方案中，构建含祀标序列片段的pU3_gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性 末端的靶标引物，将接头引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶 切后的pU3-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。 上述方案中，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体是将含靶标序列片段的 gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。 上述方案中，获得转基因苗的步骤是将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈 伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因 植株。本专利技术中将含靶标的PCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介 导的遗传转化或基因枪法。也可以是能实现其转化的其他生物学方法。 上述方案中，突变位点的鉴定步骤具体为：提取阳性植株的DNA，设计引物扩增上 述DNA，经纯化后，测序，分析突变情况。 上述方案中，获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获Ttl代实现定 点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T 1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检 测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植 株作为温敏不育株，经自交或回交等方法繁殖后获得温本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于：其包括利用CRISPR/Cas9系统根据RNase ZS1(Os02g0214300或LOC_Os02g12290)设计靶标序列的步骤；和构建含靶标序列片段的pU3‑gRNA载体的步骤；和构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和获得转基因苗的步骤；和突变位点的鉴定步骤；以及获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。
【技术特征摘要】
1. 一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于：其包括 利用 CRISPR/Cas9 系统根据 RNase ZS1 (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)设计靶标序 列的步骤；和 构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体的步骤；和 构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和 获得转基因苗的步骤；和 突变位点的鉴定步骤；以及 获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。2. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，所 述RNase ZS1双链片段中的一条链具有以下结构：5'-Nx-NGG-3'，也可以是5'-Nx-NAG-3'或 5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一个，14彡X彡30。3. 根据权利要求2所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，突 变后的特征表现为NGG或NAG或NGA上游第3个碱基与第4个碱基之间插入碱基或在其5' 和/或3'丢失喊基。4. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，构 建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性末端的靶标引物，将接头 引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上， 经PCR扩增和测序验证阳性质粒。5. 根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：周海，庄楚雄，陈亮，李静，姜大刚，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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