包含重组序列基序的构建体在增强藓类中基因表达中的应用制造技术

本发明专利技术涉及通过利用构建体提高藓类中基因表达的方法，所述构建体包含由重组序列嵌入的异源序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在真核细胞内、具体为包括于藓类中的植物细胞(例如藓类原丝体细胞)内提高基因表达的方法和材料。现有技术在哺乳动物细胞培养中用于提高重组蛋白质表达的基因扩增是常用的策略(Herlitschka等人，(1996)Protein Expr.Purif.8，358-364，Ringold等人，(1981)J.Mol.Appl.)。由于异源DNA的多拷贝整合能够触发的沉默事件，在植物中实现基因扩增策略是难以解决的(Asaad等人，(1993)Plant Mol Biol.22，1067-1085)。最近，开发了植物中的基因扩增策略以克服这些局限性。从烟草核糖体DNA的非转录间隔区分离了顺式作用遗传因子aps。将所述间隔元件与目的报道基因融合，并引起目的异源基因拷贝数增加以及由此导致的异源蛋白质的更高的表达水平(Borisjuk等人，(2000)Nature Biotechnol.18，1303-1306)。Klimyuk等人描述了涉及通过反式剪接表达异源蛋白质的另一个策略(WO02/097080)。至今，关于转基因藓类植物中拷贝数与异源基因表达的相关性知之甚少。藓类在生产重组蛋白质中的用途是相当确定的技术(EP1206561，Gorr等人，2001，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.363 Suppl.R85)。通常可以将1至约50拷贝的转化质粒中的任何一种整合到转化的藓类组织基因组中(Schaefer(2002)Annu.Rev.Plant Biol.53，477-501)。取决于使用的转化构建体的设计，可以发生同源重组(即定向整合事件)和/或异源重组(即随机或非定向整合事件)。因此，使用与藓类基因组DNA序列同源的DNA序列(即包含编码或非编码序列)用于转化，可以通过引入的或转化DNA向同源DNA基因组基因座中的整合引起一个或多个同源重组事件。使用与藓类基因组DNA序列缺乏任何可评估的同源性的DNA序列(即包含编码或非编码序列)用于转化，可以通过引入的DNA向基因组中的随机整合引起一个或多个异源重组事件。藓类是唯一已知的显示高频率同源重组的植物体系(Strepp等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，4368-4373；Schaefer(2002)Annu.Rev.Plant Biol.53，477-501)。藓类这一明显独特的性质已被用于基因的定向引入。然而，通过增加目的质粒拷贝数来扩增基因表达以产生每单位质量稳定转化的藓类组织中更高水平的蛋白质迄今尚未得到描述。令人惊讶的是，以至少两个含有至少一套重组序列的异源核酸序列转化(通常共转化)藓类组织细胞(原生质体)，在再生组织(例如藓类原丝体中含有的细胞)中会引起异源核酸构建体的整合拷贝数的增加，所述整合拷贝数的增加反过来与蛋白质表达水平的增加相关。因此本专利技术的目的是提供改进的在藓类组织所含细胞中产生目的蛋白质的方法。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了在藓类植物细胞中扩增基因表达的方法，其包括1)提供至少第一个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中该构建体在其5′末端以第一个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第一个相同方向的第二个重组序列为侧翼；2)提供至少第二个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中该构建体在其5′末端以所述第二个重组序列为侧翼，在该构建体的3′末端以与第二个相同方向的所述第一个重组序列为侧翼；以及3)将至少所述第一个和所述第二个异源核酸构建体转化到藓类植物细胞中。技术人员将理解，一旦将所述至少两个异源构建体转化到藓类植物细胞(诸如藓类原生质体，例如允许后来再生为例如小立碗藓(Physcomitrella patens)的藓类原丝体的小立碗藓原生质体)中，它们将经历重复多次的相互重组。一旦在藓类植物细胞中启动，该过程将增加整合的本专利技术的转化DNA构建体的拷贝数。因此，作为本专利技术的另一方面，提供了藓类原丝体(优选小立碗藓原丝体)，所述原丝体包含以至少两个本专利技术的互补构建体稳定转化、更优选共转化的细胞。最后，来自至少一个目的异源基因的目的异源蛋白质水平的显著增加超过了在藓类原丝体细胞中可测量的来自缺少本专利技术构建体特性的常规转化构建体的蛋白质水平。至少第一个和至少第二个重组序列形成使本专利技术的构建体可能彼此重组的互补组(complementary set)。技术人员自然会理解，根据计划利用多少个相同或不同的目的核苷酸序列来产生蛋白质，可以采用在其中可能使用一个或多个重组序列互补组(例如1、2、3、4或5或更多组)的本专利技术的构建体。为方便起见，优选使用单个重组序列互补组。本专利技术的另一方面，提供了本专利技术的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第一个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；以及3)引入的第二个重组序列。本专利技术的另一方面，提供了本专利技术的异源DNA构建体，其在5′至3′方向包含1)引入的第二个重组序列；2)至少一个目的异源核酸序列，所述核酸序列包含与其可操作地连接的启动子及任选的其终止子；以及3)引入的第一个重组序列。因此两个构建体含有定位于其中不同位点的相似的互补重组序列，所述互补重组序列使得或允许构建体在藓类原丝体(例如小立碗藓原丝体)中含有的转化的藓类原丝体细胞中彼此原位重组。本专利技术的构建体优选为线性形式。可以使用这类构建体以至少两个单独的转化事件转化藓类原生质体，其中第一个转化事件与第二个转化事件在时间上分离，或可以将本专利技术的构建体共转化到后来允许或能够再生为藓类原丝体的藓类原生质体中。转化事件优选包括以至少两个如上所述之本专利技术的构建体共转化藓类原生质体。在本专利技术的构建体中利用的重组序列可以是选自任何生物的任何序列，例如植物基因组DNA，例如小立碗藓基因组DNA、cDNA、内含子或外显子区或非编码区或其任何组合。用作重组序列的合适的基因组DNA可以包含来自外显子或内含子或二者杂交体的DNA。优选由内含子DNA或非编码区DNA形成重组序列。如在此所讨论的，两个侧翼重组序列的方向优选为相同方向，例如在两个转化构建体二者中都为5′至3′方向或为3′至5′方向，尽管重组序列在两个构建体中的实际位置如上文所提及的各不相同。技术人员自然会理解，本专利技术的异源构建体将在使二者之间能够发生重组事件的合适的位置和方向包含重组序列。本专利技术的构建体的重组核苷酸序列可以是任何长度，前提是其能够引起或允许重组事件发生。在本专利技术的构建体中采用的重组序列的合适长度在25-1000个核苷酸长度或更长；25-650个核苷酸长度；50-650个核苷酸长度；100-400个核苷酸长度；或200-400个核苷酸长度(例如约200+/-50个核苷酸长度)的范围内。技术人员将理解，本专利技术构建体的重组序列的长度可以根据设计而变化。作为本专利技术的另一方面，提供了含有本专利技术的构建体的藓类细胞、含有所述藓类细胞的藓类原丝体和/或含有本专利技术的构建体的藓类植物，具体为藓类原丝体细胞、包含含有本专利技术的构建体的原丝体细胞的藓类原丝体和本文档来自技高网...

【技术保护点】
在藓类植物细胞中扩增基因表达的方法，其包括　　　　１）提供至少第一个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述构建体在其５′末端以第一个重组序列为侧翼，在该构建体的３′末端以与第一个相同方向的第二个重组序列为侧翼；　　　　２）提供至少第二个异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含至少一个与启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述构建体在其５′末端以所述第二个重组序列为侧翼，在该构建体的３′末端以与第二个相同方向的所述第一个重组序列为侧翼；和　　　　３）将至少所述第一个和所述第二个异源核酸构建体转化到藓类植物细胞中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G戈尔，
申请(专利权)人：格林诺瓦森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]