一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1‑2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20‑30℃的温度下离心25‑45min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上。本发明专利技术制备的嵌合抗原受体T细胞具有一定的功能活性，可以为肿瘤治疗提供技术方向。

Preparation method of chimeric antigen receptor T cell

The invention discloses a method for preparing a chimeric antigen receptor of T cells, which comprises the following steps: S1, the blood is transferred to the centrifuge tube, diluted with saline and mixed evenly; S2, 3mL angiografin adding Ficoll solution, mixed liquid, the mixture into the centrifuge tube, and will the centrifuge tube is vertically placed on the operating table, the diluted blood in 1/2, and slow stirring, still 1 after 2min, then add the remaining 1/2 blood, slowly stirring until evenly mixed; S3, S2 and centrifugal good blood, angiografin solution and Ficoll tube was placed in the centrifuge. In the 20 under temperature of 30 DEG S4, 25 centrifugal 45min; S3 centrifugal centrifugal tube after operation to Taiwan, the middle layer of tunica albuginea lymphocyte layer and transferred to the culture plate. The chimeric antigen receptor T cell prepared by the invention has certain functional activity and can provide technical direction for tumor treatment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法。
技术介绍
癌症一直是困扰人类的巨大难题。我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人意味着每分钟就有6人就诊断为恶性肿瘤，这些数据都表明，癌症依然是威胁健康的一大杀手。多年来，癌症治疗的方法主要是手术、化疗和放疗，对肿瘤患者的临床治疗有效率仍旧很低，据统计，同一种抗肿瘤药物的有效率仅为25％。针对同一种肿瘤，用同样的药、标准剂量的治疗方法，在不同病人身上所起的疗效及毒副作用却有很大的差异。造成这种结果的主要原因在于，肿瘤是一种多病因、异质性的疾病。过去十年来，依赖于患者个体生物标志物的肿瘤个性化治疗正在逐渐取代依据传统经验的治疗模式，并展现出优越的疗效和广阔的前景，如伊马替尼和曲妥珠单抗。免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症；癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。虽然有关免疫治疗的研究早在30年前就已开展，最近两年《细胞》、《科学》、《自然》等国际顶级期刊刊出多项该领域的突破研究成果，制药巨头也不断推出此类型的重磅疗法。2014年12月6号至9号在旧金山举行的美国血液学会年会(ASH)上，癌症免疫疗法可谓是赚足了眼球，CAR-T疗法更是备受关注。CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世纪80年代提出的，1989首次开发出嵌合抗原受体T细胞。CART疗法即嵌合抗原受体T细胞疗法，绕过了PD疗法启动过继免疫应答这一难关，开创了跨越式发展的医学史新篇章。CART针对那不怎么靠谱的过继免疫，引入全新的概念与方法，成功地诱导出抗癌的过继免疫应答。首先CART解决了抗原的难题。既然在自然的状况下免疫系统找不到抗原，那就人为指定一种抗原。考察急性淋巴B细胞白血病的CART疗法。淋巴B细胞表面有一个分化抗原CD19，无论是正常B细胞还是癌变B细胞都有表达。选CD19为靶抗原可以确保没有漏网之鱼。接下来，怎样确保T细胞能找到CD19靶抗原？这也是CART的核心技术。自然的T细胞肯定不会将CD19当作靶抗原的。CD19表达于正常B细胞，T细胞对CD19耐受。CART将一个抗原受体嵌合到T细胞表面。这抗原受体本质是一种抗体，对CD19有很高的亲和性。两者碰到就会结合，不离不弃。于是，用抗体蛋白联接定位，T细胞就钉住了癌细胞。所以有一比喻，这抗原受体就像GPS，给T细胞导航，为找到目标提供了保证。抗体又是怎样插入进T细胞的？这是通过基因转染技术实现的。这里转染的并不是抗体本身而是编码抗体的基因，也就是说转染的是DNA。转染的DNA会编码抗体然后表达于T细胞表面。现有的嵌合抗原受体T细胞制作不标准，较为繁琐，不具有流程化操作，为此我们提出了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法。本专利技术提出的一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1-2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20-30℃的温度下离心25-45min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上；S5，将培养板放置在培养箱中培养24-48h；S6，将S5中培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续5-10天；S7，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备。优选地，所述生理盐水与血液的体积比为1：1-2。优选地，所述生理盐水与血液的体积比为1：2。优选地，所述泛影葡胺的质量体积浓度为340g/L。优选地，所述S3中，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在25℃的温度下离心35min。优选地，所述S4中，操作台为超净操作台。优选地，所述S5中，培养箱的温度为36-38℃，培养箱内的二氧化碳为4-10％。优选地，所述S5中，培养箱的温度为37℃，培养箱内的二氧化碳为7％。本专利技术中，先将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀，将泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，并将混合液放入离心管中，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1-2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀，将加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20-30℃的温度下离心25-45min，将离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上，将培养板放置在培养箱中培养24-48h，将培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续5-10天，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备，本专利技术制备的嵌合抗原受体T细胞具有一定的功能活性，可以为肿瘤治疗提供技术方向。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。实施例一本专利技术提出的一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20℃的温度下离心25min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上；S5，将培养板放置在培养箱中培养24h；S6，将S5中培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续5天；S7，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备。实施例二本专利技术提出的一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1。2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在22℃的温度下离心30min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上；S5，将培养板放置在培养箱中培养30h；S6，将S5中培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续6天；S7，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备。实施例三本专利技术提出的一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1‑2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20‑30℃的温度下离心25‑45min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上；S5，将培养板放置在培养箱中培养24‑48h；S6，将S5中培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续5‑10天；S7，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，将血液转移至离心管，用生理盐水稀释，混合均匀；S2，将3mL的泛影葡胺加入Ficoll溶液，得到混合液，将混合液放入离心管中，并将离心管竖直放置在操作台上，将稀释好的血液放入二分之一，并缓慢搅拌，静止1-2min后，再加入剩余的二分之一血液，缓慢搅拌直至混合均匀；S3，将S2中加好血液、泛影葡胺与Ficoll溶液的离心管放置在离心机，在20-30℃的温度下离心25-45min；S4，将S3中离心后的离心管移至操作台，取中间的白膜层即淋巴细胞层并转移至培养板上；S5，将培养板放置在培养箱中培养24-48h；S6，将S5中培养后的培养板上加入病毒，并放入培养箱中继续培养持续5-10天；S7，检测培养板上的细胞，并确定T细胞是否被感染，即可完成嵌合抗原受体T细胞的制备。2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，胡广，顾潮江，柳浥时，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42