一种基因敲入重组载体及其制备方法和小鼠模型制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于基因敲入的重组载体，其中，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。本发明专利技术还提供了该基因敲入重组载体的制备方法及用该重组载体制备的小鼠模型，该小鼠模型能够用来方便地通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而对IL17A基因的表达情况进行检测；不需要荧光显微镜等复杂设备；分泌型荧光素酶是通过荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应而发光，不需要激发光，所以荧光背景远低于GFP荧光，且检测灵敏度更高，背景更干净，实验结果也更加准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的涉及一种小鼠模型制备方法及基因敲入重组载体。
技术介绍
基因敲入(Knockin)是根据实验要求在目的基因位置引进特定的突变或外源基因的技术，例如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)；或将报告基因(如EGFP, mRFP, mCherry等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达并研究基因的表达谱。IL17A (白介素-17A)是细胞因子IL-17家族成员之一，在宿主防御和炎症过程中起关键作用。目前针对IL17A基因表达进行监测的模式小鼠是IL17A-GFP基因敲入小鼠模型，通过检测小鼠体内T细胞和小肠细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来分析IL17A基因的表达。此种模型只能通过可检测绿色荧光的小动物活体成像仪或处死小鼠后提取组织和细胞后用荧光显微镜观察才可检测，对实验仪器和设备要求较高，操作不够方便灵活，且荧光灵敏度低。因此有必要开发一种可通过体外检测分析IL17A基因表达情况的模型小鼠的制备方法。Gluc (Gaussia Iuciferase)是分离于夏威夷水域的一种海洋烧脚类动物(Gaussia princeps)的新型荧光素酶。荧光素酶可以催化荧光素(Iuciferin)氧化成氧化突光素(oxyluciferin),在突光素氧化的过程中，会发出生物突光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物突光。通过报告基因载体，Gaussia Iuciferase可用于哺乳动物细胞表达，并可以分泌到细胞外。与其他荧光素酶相比，使用Gaussia Iuciferase作为报告基因有更多的优势:能分泌到细胞外、灵敏、稳定、无需ATP、分子量小，可通过检测实验动物血液和尿液中荧光素酶活性，间接监测体内的生理过程。与监测体内过程常用的分泌型报告基因SEAP (secreted alkaline phosphatase)相比，Gluc具有实验时间短,线性范围宽和灵敏度高等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的用于检测IL17A基因表达的模式小鼠中存在的上述缺陷，获得可以通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而方便地对IL17A基因的表达情况进行检测的基因敲入模型小鼠及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于基因敲入的重组载体，其中，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-1RES-luc ；其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，Iuc为分泌型荧光素酶的编码基因。本专利技术还提供了一种重组载体的制备方法，其中，该方法包括将DNA片段结构IRES-1uc导入表达载体pIL17A-GFP中。本专利技术还提供了一种可以简便的检测体内IL17A基因表达的小鼠模型的制备方法，该方法包括将本专利技术所提供的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得Fl代杂合子小鼠，使雌雄Fl代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子IL17A-1UC模型小鼠。本专利技术还提供了一种检测本专利技术所制备的小鼠模型中IL17A基因表达情况的方法，该方法包括对小鼠模型的血液和/或尿液中分泌型荧光素酶的含量进行检测。本专利技术还提供了一种IL17A-1UC模型小鼠在与IL17A基因表达相关的研究中的应 用。本专利技术还提供了一种IL17A-1UC模型小鼠在筛选可诱导IL17A基因表达的药物中的应用。本专利技术还提供了一种IL17A-1UC模型小鼠在筛选可抑制IL17A基因表达的药物中的应用。通过本专利技术所提供的方法所制备的基因敲入模型小鼠具有C57BL/6遗传背景，小鼠模型的建立过程中不需要进行多次的回交，缩短了模型建立的时间。此外，利用本专利技术所提供方法制备的模型小鼠具备以下优点:(1)该模型小鼠能够用来方便地通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而对IL17A基因的表达情况进行检测；(2)不需要荧光显微镜等复杂设备；(3)分泌型荧光素酶是通过荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应而发光，不需要激发光，所以荧光背景远低于GFP荧光，且检测灵敏度更高，背景更干净，实验结果也更加准确。本专利技术所提供的模型小鼠能够广泛的应用于与自身免疫性和炎性疾病相关:如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、移植排斥及炎症性肠病等疾病的研究，以及相关药物的筛选等方面。【附图说明】图1为根据本专利技术一种实施方式的重组载体的质粒图谱。图2为对根据本专利技术一种实施方式的重组载体进行酶切鉴定的结果图。图3为对根据本专利技术一种实施方式获得的Fl代杂合子小鼠的基因鉴定。结果图。图4为根据本专利技术一种实施方式获得的F2代纯合子小鼠的基因鉴定结果图。图5为荧光酶标仪对IL17A-Gluc小鼠Gluc表达的鉴定。图6为利用IL17A-G1UC模型小鼠进行药物筛选的应用效果。【具体实施方式】本专利技术提供了一种用于基因敲入的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构 IL17A-1RES-luc ；其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，Iuc为分泌型荧光素酶的编码基因。本专利技术所提供的载体可以用于检测小鼠体内IL17A基因的表达情况。在本专利技术所提供的载体中，IRES (internal ribosome entry site),是一段非翻译RNA核酸序列，其作用是折叠成类似于起始tRNA的结构，使得连接在其后的基因可以表达。IRES可存在于RNA病毒、DNA病毒、哺乳动物、植物以及酵母中。优选的情况下，本专利技术所述的IRES具有SEQ ID NO:2所示的序列。本专利技术所提供的重组载体中包括荧光素酶的编码基因，所述荧光素酶可以选自由Gaussia突光素酶、Gaussia-Dura突光素酶、Cypridina突光素酶、Green Renilla突光素酶和Red Firefly荧光素酶所组成的组 。优选的情况下，所述分泌型荧光素酶为Gaussia荧光素酶，所述分泌型荧光素酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。在本专利技术中，所述重组载体优选是将所述DNA片段结构IRES-luc导入表达载体 pIL17A_GFP (载体相关文献信息:Peters A, Pitcher LA, et al. Thl7cells induceectopic lymphoid follicles in central nervous system tissue inflammation. Tmmunity.2011，35(6):986-96.)中得到的;表达载体pIL17A_GFP从5，末端至3，末端的结构包括:5’端IL17A基因的同源臂序列，GFP基因序列，转录终止序列SV40 polyA，5’端Cre酶识别位点LoxP，PGK启动子序列，新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，转录终止序列polyA，3’端Cre酶识别位点LoxP，3’端IL17A基因的同源臂序列，负筛选标记基因(白喉毒素A亚基基因)的编码核苷酸序列。其中，DNA片段结构IRES-1uc插入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因敲入的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A?IRES?luc；其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因敲入的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-1RES-luc ； 其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，Iuc为分泌型荧光素酶的编码基因。2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体是将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体PIL17A-GFP得到的。3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其中，所述分泌型荧光素酶选自由Gaussia突光素酶、Gaussia-Dura突光素酶、Cypridina突光素酶、Green Renilla突光素酶和RedFirefly荧光素酶所组成的组。4.根据权利要求3所述的重组载体，其中，所述分泌型荧光素酶为Gaussia荧光素酶。5.根据权利要求2或4所述的重组载体，其中，所述表达载体PIL17A-GFP从5’末端至3’末端的结构包括:5’端IL17A基因的同源臂序列，转录终止序列SV40 polyA，5’端Cre酶识别位点LoxP，PGK启动子序列，新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，转录终止序列polyA，3’端Cre酶识别位点LoxP，3’端IL17A基因的同源臂序列，负筛选标记基因的编码核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：