本发明专利技术公开了一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用，即一种含有截短的单个Frt特异性重组位点的表达载体的构建方法和应用，其特征序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其构建方法步骤为：A.质粒pBI-GFP的构建；B.DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得；C.质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建。本发明专利技术方法简单易行，操作方便，该载体在多基因转化方面具有应用价值和前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的 定向叠加。更具体地讲，本专利技术涉及一种含有35bpfrt特异性重组位点的表达载体，同时 涉及到含有frt特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该专利技术在植物转基因和基因工 程中的应用。
技术介绍
酵母FLP/Frt位点特异性重组系统为双组份系统，FLP重组酶是酵母2ym质粒编 码的特异性蛋白，可特异识别Frt位点DNA序列，Frt位点DNA序列包含长度为13bp的三个 重复单元，其中一个重复单元是其它两个重复单元的反向重复，两个反向重复单元间有8bp 的间隔序列，间隔序列的方向决定了Frt位点的方向（FutcherAB1988The2microncircle plasmidofSaccharomycescerevisiae.YeastAdT-A(X)c3FLP重组酶可与Frt位点三个重 复序列结合，并在间隔序列的边界切割DNA，引起同一DNA分子上两个Frt位点间的DNA片 段发生倒位或剔除（SenecoffJF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseofthe yeast2-micronplasmidcharacterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl. Acad.Sci. 82 :7270-7274.;AndrewsBJ，ProteauGA，BeattyLG，SadowskiPD1985The FLPrecombinaseofthe2microncircleDNAofyeast:interactionwithitstarget sequences.Cell40 :795-803.)，或者引起不同DNA分子上的DNA片段在Frt位点发生整合 (HuangLC，WoodEA，CoxMM1991Abacterialmodelsystemforchromosomaltargeting. NucleicAcidsResl9 :443-448.)D在植物基因组中，引入的FLP/Frt位点特异性重组系统已被证实同样能发 挥其功能，这些功能已在水稻和玉米（LyznikLA，MitchellJC，HiyaramaL，Hodges TK1993ActivityofyeastFLPrecombinaseinmaizeandriceprotoplasts.Nucleic AcidsRes21 :969-975.)、烟草（LloydAM，DavisRW1994Functionalexpressionofthe yeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGen Genet242 :653-657.)、拟南芥（KilbyNJ，DaviesGJ，SnaithMR，MurrayJAH1995FLP recombinaseintransgenicplants:constitutiveactivityinstablytransformed tobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ8 :637-652.) 等植物中进行了广泛的验证。 为了提高植物转基因安全性，可利用FLP/Frt位点特异性重组系统删除植物基因 组中的外源选择标记基因和报告基因。当两个Frt位点在同一DNA分子且方向相同时，FLP酶可将两个Frt位点间的基因删除。人们利用FLP/Frt重组系统已成功在烟草中删除了抗 除草剂的乙酰乳酸合成酶als基因（单晓映，李蓓，张举仁2006利用FLP/frt重组系统产 生无选择标记的转基因烟草植株.生物工程学报，22 :744-750.)、删除了gus报告基因及 发状根形成rolC基因（GidoniD，BarM，GilboaN2001FLP/FRT_mediatedrestoration of normal phenotypes and clonal sectors formation in rolC transgenic tobacco. Transgenic ResearchlO:317-328.)〇 除了利用FLP/Frt重组系统删除植物外源基因外，有时需要利用该系统进行外源 基因在受体植物基因组中进行定向叠加，达到在特定位点转化多基因的目的，此时，就需要 构建含单个Frt位点的载体。单个野生型Frt位点全长为48bp，FLP重组酶可与Frt位 点三个重复序列结合（FutcherAB1988The2microncircleplasmidofSaccharomyces cerevisiae.Yeast4 :27-40.)。已有充分的实验证据表明，Frt位点只有8bp的间隔序列 及其两侧两个反向重复序列时，Frt位点介导的重组效率没有明显的改变，甚至当一个或两 个反向重复远离间隔序列的一端缺失3bp序列时依然具有几乎同样的重组效率（Senecoff JF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseoftheyeast2_micronplasmid： characterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl.Acad.Sci. 82 :7270-7274.)〇 据此，有学者已创建了截短的Frt位点，该位点长度39bp，包含I段8bp间隔序列、2段13bp 反向重复序列及与之相邻的5bp保护序列（李蓓，单晓映，尹小燕，张举仁2006单子叶植物 的FLP/frt位点特异性重组系统的构建.山东大学学报（理学版）41:149-156.)。本专利技术 设计的frt位点包括1段Sbp间隔序列、1段Ilbp重复序列、1段13bp反向重复序列及与 之相邻的3bp保护序列，Ilbp重复序列远离间隔序列的一端去掉了 2bp的GA碱基，这样的 Frt位点具有同样的重组功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种可用于基因重组或基因叠加的含单个缩减的Frt 位点的表达载体，该载体含有无启动子的绿色荧光蛋白（GFP)及可表达的(6-葡糖醛酸酶 (GUS)报告基因，此专利技术为未来进行植物多基因的遗传转化、定向重组或叠加奠定了基础。 本专利技术的另一个目的是在于提供了 一种可用于基因重组或基因叠加的 pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos载体的构建方法，方法简便易行，试验操作方便。 本专利技术的再一个目的是在于提供了pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos表达载体 在油菜中的转化方法和应用。 -种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用，包括以下步骤： 质粒PBI-GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除PBI121载体中的⑶S基因， 同时在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI-GFP 载体； DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得：以Frtm-HindIII-GFP(5'-TGCAAGCTT AGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：质粒pBI‑GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除pBI121载体中的GUS基因，同时在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI‑GFP载体；DNA片段Frt‑GFP‑Tnos的获得：以Frtm‑HindIII‑GFP(5'‑TGC AAGCTT AGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC GGA ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCA‑3’)和Tnos‑HindIII‑3’(5'‑TGC AAGCTT CGATCTAGTAACATAGATGACACCG‑3’)为一对引物，利用LA‑Taq酶扩增pBI‑GFP，由于引物Frtm‑HindIII‑GFP含有Frt位点，通过PCR将Frt位点加在GFP‑Tnos之前，获得Frt‑GFP‑Tnos片段。Frtm代表了一种缩减的Frt位点，此位点只包含了核心序列，具有完整Frt位点的作用；质粒pBI‑Frt‑GFP‑Tnos‑35S‑GUS‑Tnos的构建：将DNA片段Frt‑GFP‑Tnos插入pBI121载体的HindIII位点，构建含有Frt特异性重组位点的表达载体T18，T18的结构为pBI‑Frt‑GFP‑Tnos‑35S‑GUS‑Tnos。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏文辉，李晨，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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