本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及ｍｉＲ１６９ｄ前体序列改造及其在基因沉默中的用途。根据本发明专利技术的改造的ｍｉＲＮＡ１６９ｄ前体序列ａｍｉＲ１６９ｄ，其核苷酸序列如ＳＥＱ Ｎｏ．２所示。本发明专利技术在ａｍｉＲ１６９ｄ前体序列的颈部结构区域设计了两个特异的酶切位点，可方便的把人工设计的目的序列插入到本发明专利技术的载体中，导入植物细胞，可有效引起靶基因沉默。被转化的植物宿主既可以是拟南芥、烟草、大豆等双子叶植物，也可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及miR169d前体序列改造及其在基 因沉默中的用途。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默是一个非常有用和有效的调控基因表达的工具， 在基因功能鉴定、植物抗病毒反应、作物品质改良以及农艺性状的改良等方面得到了广泛 的应用。在RNAi方法中，目前通用的方法是把需要沉默的目的基因构建成反向重复序列， 转录后就形成卡RNA(hpRNA)，随后被DCL酶加工成22nt的小RNA，特异性的沉默同源的靶 基因。由于hpRNA可以产生多个 22nt的siRNA，其中的部分siRNA具有作用于其它的非 靶基因的潜在能力，可能会影响其他一些无关基因的表达。随着对miRNA研究的深入，人们发现可以利用miRNA产生的原理来特异性的沉默 目的基因，其基本过程是首先获得野生型的miRNA前体(pre-miRNA)，然后根据目的基因序 列选择出特异的大小约21nt的序列，即人工miRNA(amiRNA，artificial microRNA)，最后 把pre-miRNA中的野生型的miRNA序列替换为目的序列。利用amiRNA人们可以特异高效 的沉默目的基因，如miR159a前体、miR164b前体、miR319a前体等均已用来构建人工小RNA 载体，但这些miRNA的前体较大，构建需要进行多次嵌套PCR，构建繁琐。
技术实现思路
基于此，我们对已有的miRNA及其前体进行了分析，发现miR169d特点是前体序列 短(154bp)，二级一种结构中的环比较小，且在颈部可只需要改动5个碱基就可以产生2个 特异的酶切位点，因此我们选择了 miR169d进行amiRNA载体的构建。因此，本专利技术的目的之一是提供一种改造的miR169d前体序列amiR169d。本专利技术的再一目的是提供miR169d前体序列及其改造序列的用途。本专利技术的再一目的是提供含miR169d前体序列及其改造序列的基因沉默载体。本专利技术的再一目的是提供制备上述基因沉默载体的方法。根据本专利技术改造的miR169d前体序列amiR169d，其核苷酸序列如SEQ No. 2所示， 其中由碱基“η”组成的序列为任意人工设计的miRNA分子序列。所述片段是拟南芥miR169d 前体序列(SEQ No. 1，其中由碱基“η”组成的序列为miR169分子序列，可替换为人工设计的 任意序列)经过改造而获得。本专利技术提供了 miR169d前体序列及其改造序列用于制备基因沉默载体的用途。根据本专利技术的基因沉默载体含有miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序 列，其中，所述miR169d前体序列、或经改造的miR169d前体序列中的miR169d分子序列被 特异性的人工miRNA分子取代，优选地，所述改造的miR169d前体序列具有SEQ No. 2所示 核苷酸序列。根据本专利技术的基因沉默载体可以为载体pAmiR169d，所述载体通过上述具有SEQNo. 2所示核苷酸序列的经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体pCAMBIA1303而获得。根据本专利技术的制备基因沉默载体的方法包括将miR169d前体序列，或经改造的 miR169d前体序列克隆至表达载体的步骤。本专利技术的基因沉默载体是一种能够在植物中特异沉默靶基因的人工miRNA载体。 本专利技术的专利技术人首次成功地利用miR169d前体分子及其改造序列制备基因沉默载体，其在 amiR169d前体序列的颈部结构区域设计了两个特异的酶切位点，可方便的把人工设计的目 的序列插入到本专利技术的载体中，导入植物细胞，可有效引起靶基因沉默。被转化的植物宿主 既可以是拟南芥、烟草、大豆等双子叶植物，也可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物。附图说明图1为miRNA前体的二级结构图，其中A为改造前的拟南芥miR169d的前体结构； B为改造后的miR169d前体结构；C为人工amiR-gfp的前体结构；图2为改造的人工miRNA载体pAmiR169d和pAmiR-gfp的构建图；其中35S为花 椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)蛋白基因启动子；Nos为胭脂碱合成酶(Nos)基因中止子；GUS 报告基因；LB和RB为T-DNA左右边界。图3为pAmiR-gfp对靶基因的沉默效应分析，其中，A为⑶S活性分析，B为⑶S-GFP 转录本的半定量RT-PCR，C为⑶S-GFP转录本的实时定量PCR ；图4为AmiR-gfp对⑶S-GFP转录本的切割位点分析，其中，A为5’RACE_PCR ；B为 amiR-gfp的剪切位点。具体实施例方式实施例1、PCAMBIA-35SE载体的获得利用Hindlll/EcoRI 从 pBI121 (Clontech)上切下来大约 3000bp 的 35S-GUS_Nos 片段，酶切片段经Qiagen的琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化后连入pCAMBIA1303 (CAMBIA) 的HindIII/EcoRI位点，形成中间载体pCAMBIA_35S。该质粒经EcoRI消化后，通过 T4DNA聚合酶补平粘端再自连，从而去掉了质粒pCAMBIA-35S中的EcoR I位点，命名为 PCAMBIA1303-35SE。实施例2、人工 miRNA 载体 pAmiR169d拟南芥miR169d前体序列包含154nt，能够形成一个简单的颈环结构(图1A)，对 其序列进行分析后，在不改变其二级结构特征的前提下，进行修饰改造。人工设计合成了具有重叠互补序列的8条寡核苷酸片段，在中间分别突变2个和3 个碱基，在miRNA的两端分别产生了 EcoR I和Sal I酶切位点，但不改变ath_miR169d前 体序列的二级结构(图1B)。8条寡核苷酸片段的序列如下oligo 1(5' -gatccGTATCATAGAGTCTTGCATGGA-3‘)oligo2(5' -AAAATTAAAGaattcATTGAGCCAAGGATGACTTGCCGATGTT-3')oligo3 5' -ATCAACAAATCTTAACTGATTTTGGTGTCCGGCAAGTTGACCTT-3')oligo4 5' -GGCTCTGTCGACTTCTTTTCTTTTCAATGTCAAACTCTAGATATgagct-3')oligo5(5' -cATATCTAGAGTTTGACATTGAA-3')oligo6 5' -AAGAAAAGAAgtcgacAGAGCCAAGGTCAACTTGCCGGACACCA-3')oligo7(5' -AAATCAGTTAAGGATTTGTTGATAACATCGGCAAGTCATCCTTGGC-3')oligo8(5' -TCAATCGAATTCTTTAATTTTTCCATGCAAGACTCTATGATACg-3')将8条人工合成的寡核苷酸片段经磷酸化和退火形成双链DNA，直接克隆到 PCAMBIA1303-35SE 的 BamH I 和 Sac I 位点，形成人工 miRNA 载体 pAmiR169d。实施例3、利用pAmiR169d载体沉默目的基因⑶S-GFP直接合成4条寡核苷酸片段，退火形成一段包含AmiR-gfp序列的双链DNA(如图 1C)，末端设计为EcoR I和SalI酶切位点，具体序本文档来自技高网...
【技术保护点】
改造的ｍｉＲ１６９ｄ前体序列ａｍｉＲ１６９ｄ，其特征在于，其核苷酸序列如ＳＥＱ Ｎｏ．２所示，其中，由碱基“ｎ”组成的序列为任意的人工设计序列。
【技术特征摘要】
改造的miR169d前体序列amiR169d，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，其中，由碱基“n”组成的序列为任意的人工设计序列。2. miR169d前体序列及其改造序列用于制备基因沉默载体的用途。3. 一种基因沉默载体，其特征在于，所述载体含有miR169d前体序列，或经改造的 miR169d前体序列，其中，所述miR169d前体序列、或经改造的miR169d前体序列中的 miR169d分子序列被特异性的人工设计序列取代。4.根据权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，范云六，徐妙云，张兰，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。