本发明专利技术公开了一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤：１）将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；２）分离出所述核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；３）将步骤２）所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；４）检测杂交结果。本发明专利技术可以广泛用于疾病诊断、药物靶标筛选、疾病机理等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸结合蛋白的检测方法，特别是涉及。
技术介绍
核酸结合蛋白包括双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白等。双链DNA结合蛋白是一类可以与一段特定序列的双链DNA特异结合的蛋白质分子或是蛋白质分子复合物。双链DNA结合蛋白主要包括原核生物中的阻遏子、操作子蛋白和真核生物中的转录因子等。这些双链DNA结合蛋白通过与特定序列的DNA双链(operator/promoter)结合，从而激活、抑制、减弱或是增强特定基因的表达。原核生物中的阻遏子蛋白和操作子蛋白的功能相对简单，可以调控编码细胞代谢过程所需酶类、编码抗生素耐受基因的表达，使得细胞的生理活动与外界的环境相适应；真核生物的转录因子的功能繁多，细胞周期、细胞凋亡、癌变等各种现象都与特定的转录因子密切相关。在生物体，尤其是真核生物的基因表达调控网络中，编码蛋白质的基因的表达要经过转录因子介导的转录激活，转录，转录后修饰(包括RNA的剪切、加帽和加尾)，翻译，翻译后修饰(包括磷酸化、糖基化、乙酰化等)等过程，在转录前、转录后和翻译后三个水平受到调控。转录因子介导的转录激活作为整个基因表达调控网络的第一环是非常重要的。生物体对外界环境的应激反应大多是通过特定的转录因子开启或是关闭一些特定的基因实现的。研究表明，绝大多数的真核生物的基因的表达都受到一个或是一些特定的转录因子的调节。愈是复杂的生物体，编码转录因子的基因一般愈多，基因表达调控的机制也更为复杂。据预测，人类基因组中有超过5％的编码蛋白质的基因是编码转录因子的。许多转录因子与癌症密切相关。例如有些转录因子是一些仅仅在恶性肿瘤组织中才表达或是会增强表达的原癌基因的产物(如FOS和C-Myc)，而又有一些转录因子仅仅在恶性肿瘤组织中微弱表达或是没有表达(如p53和E2F)。因此，如果可以检测生物体某一时刻的部分转录因子或是全部转录因子的表达水平，再结合已知的转录因子调控基因的数据，就可以得到转录前水平的调控信息，可能用以诊断组织是否发生癌变，还可以筛选药物靶点，研究一些细胞应激反应的机制，观察细胞的信号通路的激活或是关闭等。现有的cDNA微阵列技术可以给出全基因组水平所有转录因子编码基因的mRNA表达状况的数据。但是只有具有活性的转录因子才可以调控基因的表达，而转录因子的活性往往受到磷酸化，乙酰化，糖基化等多种修饰方式的调控，转录因子在细胞中的定位也会影响转录因子的活性，所以具有活性的转录因子的数量和转录因子的mRNA或是蛋白水平的表达状况并不是直接相关的。例如在细胞周期各个阶段中，转录因子Yin Yang 1(YY1)的mRNA和蛋白水平的表达几乎是恒定的，但是具有活性的YY1数量是随着细胞周期有规律变化。所以cDNA微阵列从理论上是不能给出生物学家感兴趣的转录因子表达谱数据的。常规的“活性”双链DNA结合蛋白(转录因子)的检测方法是凝胶滞留法(EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay，gel shift，band shift)。将待测蛋白质样品与已知的带有同位素标记的DNA双链分子混合反应后，在非变性的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于在电泳过程中，结合了蛋白质的双链核酸分子比没有结合蛋白质的双链核酸分子迁移的慢一些，电泳后通过放射自显影，可以在胶片上得到分立的电泳条带，从而可以判断是否有预期的双链核酸和结合蛋白的相互作用的发生。近年来，凝胶滞留技术也得到了一些改进，例如使用荧光或是化学放光技术替代同位素进行检测。针对非特异结合现象，使用特异的双链DNA结合蛋白的抗体进行DNA-结合蛋白复合物的检测，称为Super-shift。凝胶滞留法这项技术的出现极大地推动了DNA和蛋白质相互作用的研究工作，但是它存在着明显的缺点操作复杂；耗时耗力，往往需要一整天的时间进行实验；检测通量低，一次仅仅能对一种双链核酸结合蛋白进行检测，检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；检测如果使用同位素，对人体有潜在的伤害，如果使用化学发光或是荧光，价格昂贵。美国的BD Biosciences Clontech公司(Palo Alto，CA)推出了一种MercuryTM转录因子试剂盒(MercuryTMTranscription Factor Kit)。该试剂盒给出了用以检测转录因子的96孔板。96孔板上的每个孔里包被有带有可以与一种转录因子特异结合的核酸序列的双链DNA探针。将待检测样品加入孔中进行反应，探针就会与待测样品中对应的转录因子结合。清洗后，再加入特异识别该转录因子的一抗，再加入酶标记的二抗与一抗结合，进行化学发光检测。该技术大大缩短了传统的凝胶滞留方法的实验时间，使用化学发光技术替代了可能对人体产生伤害的同位素。但是仍然存在通量较低的问题，即一次(一个孔中进行的反应)仅仅能对一种转录因子进行检测；检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；反应需要使用特异识别转录因子的抗体，而大多数转录因子并没有满足上述方法需要的商业化的一抗。生物体内还有一些序列特异的单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白，它们大多可以调节生物体的生理活动。此外，通过体外进化(in vitro evolution)的方法，可以筛选出与靶标蛋白分子特异结合的类似于抗体的核酸配体，这些核酸结合蛋白还没有相应的高通量的分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测通量高、灵敏特异的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法。本专利技术所述提供的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。其中，步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下五种过程进行a)将步骤1)所得混合样品用常规凝胶电泳分离，经切胶、用试剂盒分离或用电洗脱得到所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。b)将步骤1)所得混合样品采用色谱柱方法分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。c)将步骤1)所得混合样品通过滤膜，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述滤膜可以吸附蛋白。d)将步骤1)所得混合样品中加入可以特异识别各个核酸结合蛋白的抗体，使用类似于抗体纯化的方法(例如使用protein A/G包被的agarose珠体结合抗体)，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。e)将步骤1)所得混合样品用毛细管电泳设备进行分离，自动收集所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。本专利技术方法可命名为“末端标记法”，可以用来检测核酸结合蛋白，如双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白，RNA结合蛋白(如HuB，HuC，ELAV等)等，通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体(如凝血酶(thrombin)的核酸配体(ap本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤：１）将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；２）分离出所述核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；３）将步骤２）所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；４）检测杂交结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵威，赵永超，孙义民，乔继英，魏华江，杨卫平，周玉祥，程京，
申请(专利权)人：博奥生物有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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