一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术提供的检测Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括Ａ型禽流感病毒通用引物ＮＰＦ和ＮＰＬ，Ｈ５亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物Ｈ５Ｆ和Ｈ５Ｌ以及Ｎ１亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物Ｎ１Ｆ和Ｎ１Ｌ；所述ＮＰＦ具有序列表中序列１的核苷酸序列，所述ＮＰＬ具有序列表中序列２的核苷酸序列，所述Ｈ５Ｆ具有序列表中序列３的核苷酸序列，所述Ｈ５Ｌ具有序列表中序列４的核苷酸序列，所述Ｎ１Ｆ具有序列表中序列５的核苷酸序列，所述Ｎ１Ｌ具有序列表中序列６的核苷酸序列。本发明专利技术的方法及试剂盒不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒检测领域中一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒所引起的禽类烈性传染病，发病急，传播快，致死率高，对养殖业可造成致命性的打击。高致病性禽流感病毒的亚型通常为H5和H7亚型；2004年，发生于中国和亚洲其他国家和地区的流感病毒亚型主要为H5N1亚型，由于该亚型不仅对亚洲的养殖业造成了严重的经济损失，而且在泰国、越南还造成了人的感染与死亡，因而又具有重要的公共卫生学意义。在流禽感的控制环节中，最重要的是要进行快速的诊断，及时划定疫点、疫区，并采取封锁等控制措施，防止疫情的扩散。因此，建立一种灵敏、特异、快速的诊断方法具有重要的现实意义。传统的流感病毒检测方法为采用鸡胚进行病毒的分离培养，然后采用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验进行亚型的鉴定，试验费时、费力，不能做出快速而及时的诊断。因此，临床上，迫切需要一种能快速诊断H5N1亚型禽流感病毒的检测方法，不但能够确定病毒是否为A型流感病毒，而且能确定是否为H5血凝素亚型和N1神经氨酸酶亚型。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种能快速检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒。本专利技术所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。序列表中的序列1由20个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成，序列表中的序列3由19个碱基组成，序列表中的序列4由19个碱基组成，序列表中的序列5由20个碱基组成，序列表中的序列6由21个碱基组成；其中，m＝a或c，y＝t或c，r＝a或g，k＝g或t，w＝a或t。所述A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL的PCR扩增产物长度为467bp；所述H5血凝素特异性引物H5F和H5L的PCR扩增产物长度为543bp；所述N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L的PCR扩增产物长度为368bp。所述引物NPF，NPL，H5F，H5L，N1F和N1L包含于多重RT-PCR反应液中，每43.8μl所述多重RT-PCR反应液含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)。为了便于现场检测，所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶，AMV反转录酶，提取样品总RNA所需试剂(如裂解液，氯仿，异丙醇，乙醇，RNase free水)以及电泳检测试剂(如溴化乙锭，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液，标准PCR产物)。所述标准PCR产物为从已鉴定的H5N1亚型流感病毒提取RNA，反转录后以cDNA为模板，以H5F和H5L为引物扩增并回收的545bp PCR扩增产物；以NPF和NPL为引物扩增并回收的467bp PCR扩增产物以及以N1F和N1L为引物扩增并回收的368bp PCR扩增产物的混合产物。所述RNA酶抑制剂规格为30U/μl。为了在实验中避免由于人为操作所造成的假阴性或假阳性，该试剂盒还包括阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)和阴性对照液(RNase free水)。本专利技术的第二个目的是提供一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的方法。本专利技术所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的方法，是以被检样品的总RNA为模板，利用上述检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒进行多重RT-PCR反应，被检样品若同时出现467bp、543bp和368bp的扩增带，被检样品为H5N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和543bp的扩增带，被检样品为H5亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和368bp的扩增带，被检样品为N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若只出现467bp的扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阳性；被检样品若不出现扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阴性。所述多重RT-PCR反应的50μl反应体系包括43.8μl多重RT-PCR反应液(含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mMMgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)；0.8μl RNA酶抑制剂(规格为30 U/μl，Genview公司生产)，0.8μl Taq DNA聚合酶，0.6μl AMV反转录酶，4.0μl待检样品总RNA。所述多重RT-PCR反应的循环程序为42℃ 45min；95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 40s，65℃ 2min进行35个循环；65℃延伸10min。本专利技术巧妙地利用了多重RT-PCR方法，制备了一步法快速检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒。该试剂盒能特异、灵敏地检测出H5N1亚型禽流感病毒的感染。而且其制备容易，操作简单，敏感性高，反应快速(可在5小时内完成对H5N1亚型禽流感病毒的检测与鉴定)。不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查，具有良好的应用前景。具体实施例方式实施例1、样品的采集和处理1、样品的采集组织样品病死或扑灭病禽，取肝、脑、肺等组织；棉拭子鼻腔拭子、泄殖腔拭子。2-8℃保存，送实验室检测。要求送检病料新鲜。2、样品处理每份样品分别处理(1)组织样品处理称取待检病料100mg置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)研磨，把研磨好的病料移至1.5ml离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl上述裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。(2)全血样品处理待血凝后，取血清于1.5ml灭菌离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。(3)棉拭子处理将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4℃ 8000rpm离心5min，取上清液250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。3、阳性对照处理取阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括Ａ型禽流感病毒通用引物ＮＰＦ和ＮＰＬ，Ｈ５亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物Ｈ５Ｆ和Ｈ５Ｌ以及Ｎ１亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物Ｎ１Ｆ和Ｎ１Ｌ；所述ＮＰＦ具有序列表中序列１的核苷酸序列，所述ＮＰＬ具有序列表中序列２的核苷酸序列，所述Ｈ５Ｆ具有序列表中序列３的核苷酸序列，所述Ｈ５Ｌ具有序列表中序列４的核苷酸序列，所述Ｎ１Ｆ具有序列表中序列５的核苷酸序列，所述Ｎ１Ｌ具有序列表中序列６的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，魏卉玲，周迎春，樊玉磊，王帅，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]