用于检测副溶血弧菌的耐热性溶血素基因的检测试剂制造技术

本发明专利技术涉及一种检测试剂，其用于在特异性扩增ＴＤＨ　　ＲＮＡ的扩增程序中检测耐热性溶血素（ＴＤＨ）基因，该试剂包括具有与来自ＴＤＨ基因中的ＲＮＡ的特定序列互补的序列的第一引物，以及具有与所述特定序列同源的序列的第二引物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于在临床检验、公共卫生、食品检查和食物中毒检验中检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检测试剂。
技术介绍
副溶血弧菌通常被认为是一种导致感染性食物中毒的致病微生物。从肠胃炎患者中分离的副溶血弧菌之95％或甚至更多为在Wagatsuma培养基上表现溶血活性的神奈川现象阳性菌株，与之不同，从鱼类和水中分离的菌株99％都是神奈川现象阴性。因此，人们认为在致病副溶血弧菌和神奈川现象之间存在密切联系。随后，这种神奈川现象的出现被确定为是由于副溶血弧菌向细菌细胞外释放耐热性溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)所引起的，这导致对副溶血弧菌作为致病因子的关注的提升。目前TDH基因已知存在TDH1至TDH5五种类型。更近来，从一种尽管是神奈川现象阴性但显示致病性的微生物株系中，鉴定出一种具有相似于TDH的碱基序列且具有部分共同抗原性的溶血素(TDH-相关溶血素)。目前该TRH基因已知存在TRH1和TRH2两种类型。尽管涉及在扩增培养或分离培养之后评价神奈川现象以检测和鉴定副溶血弧菌的方法是已知的，但就检测的灵敏度、快捷性和简便性而言，优选对副溶血弧菌基因或来自所述基因的RNA中存在的特定序列进行扩增后检测该序列的方法。在检测系统的自动化方面特别优选恒温下扩增靶核酸的方法。已经报道了一种检测和鉴定副溶血弧菌的方法，其中在比较低的温度(41℃)下特异性扩增来自TDH基因的RNA(日本未审专利公开2001-258570和2001-340086)。在此方法中使用RNA扩增法，其中以来自所述TDH基因的特定RNA序列为模板，通过RNA依赖型DNA聚合酶，使用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物制备cDNA而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在5’末端被添加了一段RNA聚合酶的启动子序列，通过核糖核酸酶H降解双链RNA-DNA中的RNA，从而获得单链DNA，以所述的单链DNA作为模板，通过DNA依赖型DNA聚合酶合成具有启动子序列的双链DNA，其能转录成由前述RNA序列或该RNA序列的互补序列组成的RNA，其中所述的双链DNA在RNA聚合酶存在下生成RNA转录产物，所述的RNA转录产物作为模板用于随后的通过RNA依赖型DNA聚合酶的cDNA合成中。在一个优选实施方案中，此RNA扩增法在标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸的存在下进行，并且通过测定反应溶液的荧光强度来进行检测；其中，所述寡核苷酸的序列至少互补于RNA转录产物的部分序列，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物发生互补结合的情况下，与没有生成复合物的情况比较，反应溶液的荧光性质发生改变。然而，前述方法在灵敏度和速度方面存在问题。日本未审专利公开.2001-340086记载了，在起始RNA量为103拷贝时检测TDH RNA，荧光强度比率随时间的增长速度显著慢于起始量为104拷贝时的情形。结果，即使用30分钟的反应时间，荧光强度比率至多为2.0。另外，甚至当起始RNA量为0拷贝时，荧光强度比率也趋向增长，结果，即使用30分钟的反应时间，在102拷贝的起始RNA量下检测TDH RNA时，也不能观测到荧光强度比率的显著增长。因此，本专利技术的目的是提供一种更灵敏和快捷的检测TDH RNA的试剂。
技术实现思路
为了开发一种用于检测副溶血弧菌耐热性溶血素(TDH)的更灵敏和更快捷的检测试剂，经过深入研究，本专利技术的专利技术人开发了一种即使在20分钟内、102拷贝的起始RNA量下也能检测TDH的试剂。本专利技术涉及一种用于检测存在于样品中的副溶血弧菌TDH基因的检测试剂，其被用于使用包括以下步骤的RNA扩增程序的检测方法中使用来自所述TDH基因的RNA的一段特定序列，即，所述RNA的至少部分序列，作为模板，通过RNA依赖型的DNA聚合酶，应用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，从而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物的序列在其5’末端被添加了RNA聚合酶的启动子序列；通过核糖核酸酶H降解双链RNA-DNA中的RNA部分，从而产生单链DNA；和以所述的单链DNA作为模板，通过DNA依赖型的DNA聚合酶，合成具有所述启动子序列的双链DNA，该DNA能转录成由所述RNA特定序列或互补于所述的RNA特定序列的序列组成的RNA；其中，双链DNA在RNA聚合酶存在下合成RNA转录产物，所述的RNA转录产物作为模板用于随后的通过RNA依赖型DNA聚合酶的cDNA合成中；所述的试剂包括，第一引物，其为由SEQ.ID No.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者在由SEQ.ID No.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列的寡核苷酸，或者在高严格条件下可以与由SEQ.ID No.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸杂交的、能特异性结合到所述特定序列的寡核苷酸；和第二引物，其为由SEQ.ID No.1所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者在由SEQ.ID No.1所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合所述特定序列之互补序列的寡核苷酸，或者在高严格条件下可以与由SEQ.ID No.1所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸杂交的、能特异地结合到所述特定序列之互补序列上的寡核苷酸。高严格条件指诸如在以下实施例中给出的在44℃温度，60mM Tris、17mM氯化镁、110mM氯化钾和1mM DTT存在下进行杂交的杂交条件。优选的，上述的第一引物可以是由SEQ.ID No.2所示的序列组成的寡核苷酸，上述的第二引物可以是由SEQ.ID No.1所示的序列组成的寡核苷酸。此外，在打算检测与TDH基因来源的RNA互补的RNA时，具有自5’末端到3’末端序列倒转时与上述的第一引物互补的序列的寡核苷酸被用作第一引物，具有自5’末端到3’末端序列倒转时与上述的第二引物互补的序列的寡核苷酸被用作第二引物。优选的，上述RNA扩增程序在一段剪切寡核苷酸存在下进行，该寡核苷酸可在上述特定序列的5’末端剪切上述靶RNA，并且具有互补于与所述特定序列的5’末端相邻和重叠的区域的序列。所述的寡核苷酸优选为由SEQ.ID No.4，5或6所示的序列组成的寡核苷酸。更优选的，上述的RNA扩增程序在一段标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸的存在下进行，而副溶血弧菌耐热性溶血素的检测通过测量反应溶液的荧光强度来进行。这里，所述寡核苷酸的序列与mRNA转录产物的至少部分序列互补，在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物发生互补结合的情况下，与没有复合物形成时比较，反应溶液的荧光性质发生改变。优选的，上述的寡核苷酸由SEQ.ID No.3所示序列中的至少10个连续碱基组成。以下提供本专利技术的详细说明。附图简述附图说明图1显示在实施例1中用到的每个寡核苷酸沿着扩增区域所在的位置。图中碱基编号根据文献(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457(1992))给出。图2(A)显示实施例2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测样品中存在的副溶血弧菌耐热性溶血素（ＴＤＨ）基因的检测试剂，该检测试剂被用于使用ＲＮＡ扩增程序的检测方法中，所述ＲＮＡ扩增程序包括以下步骤：以一段来自所述ＴＤＨ基因的ＲＮＡ的特定序列作为模板，通过ＲＮＡ依赖性ＤＮＡ聚合酶，应用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物，生成ｃＤＮＡ，由此形成双链ＲＮＡ－ＤＮＡ，其中第一引物或第二引物在其５’末端添加了ＲＮＡ聚合酶的启动子序列；通过核糖核酸酶Ｈ降解所述双链ＲＮＡ－ＤＮＡ中的ＲＮＡ部分，从而生成单链ＤＮＡ；和以所述的单链ＤＮＡ作为模板，通过ＤＮＡ依赖性ＤＮＡ聚合酶，产生具有所述启动子序列的双链ＤＮＡ，其中所述双链ＤＮＡ能转录为由所述特定ＲＮＡ序列或者所述特定ＲＮＡ序列的互补序列组成的ＲＮＡ；其中，该双链ＤＮＡ在ＲＮＡ聚合酶的作用下生成ＲＮＡ转录产物，所述ＲＮＡ转录产物作为模板用于随后通过ＲＮＡ依赖性ＤＮＡ聚合酶合成ｃＤＮＡ；所述的试剂包括，第一引物，其是由ＳＥＱ．ＩＤＮｏ．２所示序列的至少１０个连续碱基组成的寡核苷酸，或者是从ＳＥＱ．ＩＤＮｏ．２所示序列的至少１０个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列上的寡核苷酸；和第二引物，其是由ＳＥＱ．ＩＤＮｏ．１所示序列的至少１０个连续碱基组成的寡核苷酸，或者是从ＳＥＱ．ＩＤＮｏ．１所示序列的至少１０个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列的互补序列上的寡核苷酸。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：益田升佳，堀江隆一，保川清，
申请(专利权)人：东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]