一种高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法技术

一种高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法,其特征在于，包括以下步骤：步骤1）制备反应液反应液组成及含量为8u/ul?Bst核酸聚合酶????????????????????????8u10X耐热聚合酶反应缓冲液???????????????1X,MgSO4?2mM4M?甜菜碱???????????????????????????????????1M10mM?d?NTP混合液??????????????????????????400μM内引物???VP?FIP??????????????????????????????????40umol???VP?BIP??????????????????????????????????40umol外引物???VP?F3??????????????????????????????????5umol???VP?B3??????????????????????????????????5umol标本核酸???????????????????????????????????20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;步骤2）使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。本专利技术通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测副溶血性弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。【专利说明】
本专利技术涉及疾病检测
，具体的说，是。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存I个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。快速检测副溶血性弧菌，对提高副溶血性弧菌引起的检测和诊断效率，确定有效治疗方案具有很大意义。环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本专利技术结合环介导等温扩增技术，设计针对副溶血性弧菌的特异性基因序列的一对外引物(VP-F3和VP-B3)和一对内引物(VP-FIP和VP-BIP)进行环介导等温扩增。
技术实现思路
本专利技术公开了，提高了它的检测和诊断效率。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现: 一种高特异高敏感检测副溶血性弧`菌的方法，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 VP-FIP40umol VP-BIP40umol 外引物 VP-F35umol VP-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;步骤2)使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。进一步的，所述外引物VP-F3的序列为GCGCAAGGTTACAACATC。进一步的，所述外引物VP-B3的序列为CACACTCAGAGCGCAATG。进一步的，所述内引物VP-FIP的序列为 TCACGAAACCGTGCTCTTCTG-GTTGTTTGATACTCACGCCT。进一步的，所述内引物VP-BIP 的序列为 GCGAGCGATCCTTGTTTGGA-GTACTTGATGCATGTAATCGA。进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。本专利技术的有益效果是:本专利技术通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测副溶血性弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。【具体实施方式】下面将结合实施例，来详细说明本专利技术。，包括以下步骤:【权利要求】1.，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 VP-FIP40umol VP-BIP40umol 外引物 VP-F35umol VP-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul; 步骤2)使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 VP-F3 的序列为 GCGCAAGGTTACAACATC。3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 VP-B3 的序列为 CACACTCAGAGCGCAATG。4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述内引物VP-FIP的序列为TCACGAAACCGTGCTCTTCTG-GTTGTTTGATACTCACGCCT。5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述内引物 VP-BIP 的序列为 GCGAGCGATCCTTGITTGGA-GTACTTGATGCATGTAATCGA。6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。【文档编号】C12R1/63GK103725765SQ201210385753【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2012年10月12日 【专利技术者】金京勋 申请人:苏州四同医药科技有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高特异高敏感检测副溶血性弧菌的方法,其特征在于，包括以下步骤：步骤1）制备反应液反应液组成及含量为8u/ul?Bst核酸聚合酶????????????????????????8u10X耐热聚合酶反应缓冲液???????????????1X,MgSO4?2mM4M?甜菜碱???????????????????????????????????1M10mM?d?NTP混合液??????????????????????????400μM内引物???VP?FIP??????????????????????????????????40umol???VP?BIP??????????????????????????????????40umol外引物???VP?F3??????????????????????????????????5umol???VP?B3??????????????????????????????????5umol标本核酸???????????????????????????????????20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;步骤2）使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金京勋，
申请(专利权)人：苏州四同医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：