核酸标记方法以及核酸标记用液组合物技术

本发明专利技术提供尽可能控制标记物质使用量的而且可以有效地将标记物质掺入到产物（作为检测对象的靶核酸）中的核酸标记方法。本发明专利技术的方法是通过对产物中含有的靶核酸序列通过ＰＣＲ法边扩增、边标记时，至少使用从ＡＴＣＧ４种底物中至少选择１种作为进行标记的底物，使被选择的底物的浓度比没有被选择的剩下的各个底物的浓度都低，而且是被选择的底物中被标记的底物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的核酸标记方法是特征如下的核酸标记方法在边掺入标记底物，边通过PCR法进行靶核酸扩增的核酸标记方法中，选择ATCG的4种底物中的一种至3种的底物，与没有被选择的剩下的底物相比，将上述被选择的底物的浓度减少，而且作为上述被选择的底物含有无标记脱氧核苷酸和带标记脱氧核苷酸。 另外，本专利技术中涉及的靶核酸的检测方法是特征如下的靶核酸检测方法在使含有靶核酸的产物与固定于固相上的探针反应，利用标记对与固相上探针杂交的上述靶核酸进行检测的靶核酸检测方法中，对于上述产物通过上述的核酸标记方法将该产物中含有的靶核酸做成实施了标记的PCR产物之后，与上述固相上的探针反应。 另外，本专利技术中涉及的用于核酸标记的PCR用溶液组合物是特征如下的溶液组合物作为边掺入标记物质，边通过PCR进行靶核酸扩增时的含有ATCG的4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度比没有被选择的剩下的脱氧核苷酸的浓度低，相对于上述被选择的脱氧核苷酸，含有带标记脱氧核苷酸。 另外，本专利技术涉及到的用于检测靶核酸的试剂盒含有如下引物和探针 A)用于扩增靶核酸的PCR引物， B)作为含有ATCG 4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度比没有被选择的剩下的脱氧核苷酸的浓度低，相对于上述被选择的脱氧核苷酸，含有带有标记的脱氧核苷酸， C)在固相上配置了用于与上述靶核酸反应的探针的固相探针。 固相探针最好是DNA微阵列。 利用本专利技术的核酸标记方法在边掺入标记底物，边通过PCR法进行靶核酸扩增时，对于添加了带标记脱氧核苷酸的底物通过将浓度调低，可以更有效地掺入标记物质。而利用本专利技术的靶核酸的检测方法，通过固相杂交可以使靶核酸的检测灵敏度提高。 附图说明 图1表示在pUC118 EcoRI/BAP中两个引物以及一个探针的图。箭头表示在各个引物中由5’至3’的方向。 具体实施例方式 本专利技术的核酸标记方法其特征是在边掺入标记底物，边通过PCR(聚合酶链式反应)法进行靶核酸扩增时，选择A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)4种底物中一种至3种底物作为赋予标记的底物，使上述被选择的底物的浓度比没有被选择的剩下的底物的浓度低，而且在选择的底物中含有带标记脱氧核苷酸。另一特征是将作为选择的底物的“无标记脱氧核苷酸”和“带标记脱氧核苷酸”的总浓度调整到比没有被选择的各个底物的浓度都低。通过使用这样标记化条件的PCR扩增，制备产物，靶核酸在扩增过程中可以有效地掺入标记物质。 另外，带标记脱氧核苷酸的浓度越高，越有利于标记物质的掺入。作为被选择的底物中的带标记脱氧核苷酸，如果将PCR反应液中的浓度调整到20μM以上，本专利技术可更有效地发挥作用。将没有被选择的碱基在PCR反应液中的脱氧核苷酸的浓度调整为150～300μM，被选择的底物浓度调整为没有被选择的底物的5～80％(摩尔数基准)，优选将被选择的底物中带标记脱氧核苷酸对被选择的底物中的无标记脱氧核苷酸的比例(摩尔基准数)调整到0.25以上。另外，更优选将被选择的底物调整到没有被选择的底物的10～40％(摩尔基准数)。最优选如果将作为被选择的底物中的带标记脱氧核苷酸对无标记脱氧核苷酸的比例(摩尔基准数)调整到1以上。在这样的条件下进行产物制备，即使少量的带标记核苷酸也可以有效地将标记物质掺入到靶核酸中。 作为标记物质，无论什么样的标记物质都可以没有特别限制地用于本专利技术，但一般使用可高灵敏度检测的荧光物质等。其中，以Cy3、Cy5为代表的CyDye(Amersham Bioscience公司生产)常用作核酸标记用的荧光物质，这些荧光物质在本专利技术中特别有效。另外，生物素、氨基烯丙基系化合物等核酸标记用物质在本专利技术的产物制备方法中也都有效。 进行本专利技术产物制备的靶核酸可以用于通过固相上杂交进行检测中。虽然利用本专利技术的PCR有时产量低，但在可高灵敏度地对少量产物进行检测的检测装置中可以特别发挥作用。其中，对DNA微阵列特别有效。另外，优选DNA微阵列的每一点的面积在10-6平方米以下。点面积的下限可以根据相应于目的分析用途使用的扫描器等用于测定结果的仪器的灵敏度等设定，例如也可做小到10-12平方米左右。 另外，本专利技术还提供在上述制备方法中使用的溶液组合物。 以下对于本专利技术的核酸标记方法进行更详细说明。 本专利技术提供的核酸标记方法通过在作为利用PCR对靶核酸序列进行扩增时使用的底物ATCG 4种脱氧核苷酸中，选择1种至3种底物，使被选择的底物的浓度比没被选择的底物浓度低，而且作为被选择的底物至少使用带标记脱氧核苷酸实施。特别是作为赋予标记的底物选择的底物可以使用赋予标记和没有实施标记的底物的混合物，通过将没有实施标记的底物的浓度调整到比作为实施标记没有被选择的底物浓度都低，使带有标记的底物所占的比例增大，可以有效地掺入标记物质。 另外，通过将被选择的底物的浓度调整到比没被选择的底物的浓度都低，可以获得更好的效果。例如，选择T作为标记底物时，将没有标记的dTTP和标记的dUTP并用，使dTTP和标记的dUTP的总量比没有标记的dATP、dCTP以及dGTP的各个浓度都低。 另外，被选择的底物和没有被选择的底物的上述关系以及下面叙述的关系可各自独立应用于各个底物。例如，被选择的底物是2种时，每一种都可以应用对于没有被选择的2种底物中的每一个底物的浓度关系。 另外，“底物”表示“dATP”、“dTTP”、“dCTP”以及“dGTP”脱氧核苷酸的种类。 在PCR中，酶高效作用的的脱氧核苷酸的浓度为200μM左右(Takara公司生产Ex Taq等)。从酶的底物特异性观点看，原来带标记脱氧核苷酸难以掺入。因此有关选作标记的底物，将其整体的制备浓度调低到例如100μM左右，最好将带标记脱氧核苷酸调整到例如其中的50μM，结果在得到的含有靶核酸序列的PCR产物中可以掺入更多的标记物质。通过将选作标记的底物之中的没有被标记的脱氧核苷酸的量减少，具有反应少许停止，使得难以大量掺入的带标记脱氧核苷酸变得容易掺入的效果。另外，即使将脱氧核苷酸的量增减30％左右，本专利技术的产物制备方法也是有效的。 因此，将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有被标记的底物的合计浓度)调整到没有被选作进行标记的各个底物的浓度的5％至80％(摩尔基准数)之间比较好。而将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有被标记的底物的合计浓度)调整到没有被选作进行标记的各个底物的浓度的10％至40％(摩尔基准数)之间更好。另外，最好是将没有被选作进行标记的各个底物的浓度调整到150μM～300μM。另外，最好是将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有标记的底物的合计浓度)调整到20μM以上。另外，将选作进行标记的底物的总量中的“带标记脱氧核苷酸”对“没有标记的脱氧核苷酸”的比例(摩尔基准数)调整到0.25以上，最好是调整到1以上。而其上限为50左右好。 作为具有靶核酸的碱基序列被扩增的PCR产物的碱基长度虽然没有特别限制，但在100至2000bp之间特别有效。 标记物质可以使用荧光物质等。其中，以Cy3、Cy5为代表的CyD本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸标记方法，是在边掺入标记底物边经ＰＣＲ法进行靶核酸扩增的核酸标记方法中，其特征是：选择ＡＴＣＧ４种底物中的１种至３种底物，与没有被选择的剩下的底物相比，使上述被选择的底物的浓度减少，而且作为上述被选择的底物含有无标记脱氧核苷酸和带标记脱氧核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：石井美绘，铃木智博，
申请(专利权)人：佳能株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[]