一种猪苓菌核多糖的提取制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种猪苓菌核多糖的制备方法：猪苓菌核乙醇浸泡、蒸馏水提取后，提取液浓缩，然后加入95％-100％的乙醇醇沉，取乙醇终体积浓度为60％的醇沉组分，先用阴离子交换柱分离提纯，梯度洗脱后再用凝胶过滤色谱柱分离，制得猪苓菌核多糖。本发明专利技术方法制得的猪苓菌核多糖为均一多糖，具有抗氧化活性，可以清除DPPH自由基，可用于制备抗氧化剂。

【技术实现步骤摘要】
一种猪苓菌核多糖的提取制备方法及其应用
：本专利技术涉及一种猪苓菌核多糖的制备方法及其应用。
技术介绍
：猪苓(Polyporusumbellatus)隶属于无隔担子菌亚纲、无褶菌目、多孔菌科、多孔菌属，主要是由菌核和子实体两部分构成。猪苓菌核为一味名贵的中药材，在我国已有2000多年的药用历史，具有利水、渗湿、解热之效，常被用于治疗急性肾炎、淋病、糖尿病、全身浮肿、小便不畅、尿急尿频、尿道疼痛、受暑水泻以及急性肝炎、急性胃炎等疾病。现代医学研究发现猪苓菌核水煎提取物具有治疗慢性病毒性肝炎及抗肿瘤的作用。多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键链接而成的高分子聚合物，是自然界含量最丰富的物质之一，也是与人类生活紧密相关的一类生物大分子。与蛋白质和核酸相比，组成多糖的糖残基种类繁多，不仅含有不同的异头构型而且可以连接不同的取代基；同时每个糖单体具有多种链接位点，这些都使得多糖具有非常复杂的结构，同时也具有装载丰富生物信息的能力。多糖已成为继蛋白质和核酸研究之后探索生命奥秘的第三里程碑，已吸引了越来越多学者的兴趣。目前许多研究已证明多糖具有多种生物活性和功能，特别是对机体免疫功能的作用，这些都使得多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。而且全球已有多个多糖已经或正在分别进行正规的抗肿瘤、抗艾滋病及糖尿病治疗等临床试验。除了生物活性的研究之外，多糖的结构也是许多相关研究者的主要研究焦点之一，因为多糖结构决定着其生物活性和功能，结构的阐述是理解其活性以及被更好地开发利用的基础。而获得均一的多糖组分是糖类结构研究的前提，也是难点和关键点之一。猪苓多糖具有免疫刺激作用，可提高人体免疫力，能显著降低肝脏中的氧化消除自由基损伤，对于延缓组织细胞老化、保护机体、抗老防衰十分有益，是中药猪苓菌核的重要活性成分之一。我国已有猪苓多糖注射液、猪苓多糖胶囊等产品问世，并在临床及日常保健中广为应用。目前有关猪苓多糖的研究多集中于粗多糖的活性，均一多糖的研究则鲜有报道。一些有关猪苓多糖的专利也已被公开，如专利CN102048769A公开了一种猪苓总多糖的提取工艺，该专利技术采用索氏提取法，乙醇沉淀获得猪苓多糖，多糖质量分数约20％；专利CN101602812A公开了一种猪苓多糖的制备方法，该方法采用水煎煮，乙醇醇沉，大孔树脂吸附，获得多糖含量较高的产品；专利CN101525389A公开了一种猪苓多糖精制中的脱色方法，该方法采用热水提取，乙醇醇沉获得粗多糖，利用活性炭对粗多糖进行脱色处理，并确定脱色的最佳工艺条件。目前已公开的猪苓多糖的相关专利均为粗多糖、多糖含量低，或为非均一多糖，并没有涉及单一猪苓均一多糖组分及其结构和活性。
技术实现思路
：本专利技术提供了一种猪苓菌核多糖，该多糖具有清除DPPH自由基的活性，可用于制备抗氧化剂。本专利技术提供了一种猪苓菌核多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)干燥的猪苓菌核，经粉碎得到猪苓菌核粉末，猪苓菌核粉末用体积分数95％-100％的乙醇充分浸泡，过滤，得滤渣；(2)步骤(1)所得的滤渣加蒸馏水，90-100℃提取2-4h，重复提取3～4次，过滤，合并所有的上清液，所得上清液A减压浓缩至原体积的1/10，得到浓缩液A；(3)向步骤(2)得到的浓缩液A中缓慢加入体积分数95％-100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为30％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，得到沉淀I和上清液I，上清液I中缓慢加入体积分数95％-100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为60％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，收集沉淀II，真空冷冻干燥，得到醇沉组分；(4)将步骤(3)得到的醇沉组分加蒸馏水溶解，离心，得上清液B，上样于阴离子交换柱，依次用水、0.1mol/L氯化钠水溶液、0.2mol/L氯化钠水溶液、0.4mol/L氯化钠水溶液进行梯度洗脱，苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖含量，收集0.2mol/L氯化钠水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩至所得浓缩液B中氯化钠浓度达到饱和，将浓缩液B上样于凝胶过滤色谱柱，用蒸馏水洗脱，苯酚硫酸法检测，收集含有多糖的洗脱液，浓缩、真空冷冻干燥后制得猪苓菌核多糖。所述步骤(1)中，体积分数95％-100％的乙醇的体积用量以猪苓菌核粉末的质量计为8-10L/kg。所述步骤(1)中，所述浸泡优选浸泡3～4次，每次浸泡12～16h。所述步骤(2)中，蒸馏水的质量用量为猪苓菌核粉末的质量的10-20倍。所述步骤(4)中，醇沉组分加蒸馏水溶解，所述蒸馏水的体积用量以醇沉组分的质量一般计为0.1～0.2mL/mg。所述步骤(4)中，所述的离子交换柱的填料为DEAE-SepharoseFastFlow(二乙氨乙基-琼脂糖快速流)阴离子交换树脂，层析柱规格为26cm内径×100cm高度，上样量5-15mL，流速3mL/min；所述步骤(4)中，所述梯度洗脱的程序优选为：依次用水洗脱1～2个柱体积，0.1mol/L氯化钠溶液洗脱1.5～3个柱体积，0.2mol/L氯化钠溶液洗脱1.5～3个柱体积，0.4mol/L氯化钠溶液洗脱1～3个柱体积，洗脱结束后，离子交换柱用1mol/L的氯化钠水溶液再生，再用水平衡4-5个柱体积。进一步，所述步骤(4)中，所述梯度洗脱的程序更优选为：依次用水洗脱1个柱体积，0.1mol/L氯化钠溶液洗脱2个柱体积，0.2mol/L氯化钠溶液洗脱2个柱体积，0.4mol/L氯化钠溶液洗脱1个柱体积，洗脱结束后，离子交换柱用1mol/L的氯化钠水溶液再生，再用水平衡4-5个柱体积；所述步骤(4)中，所述的凝胶过滤色谱柱的填料为SephacrylS-500HR(丙烯葡聚糖凝胶)，层析柱规格为16cm内径×100cm高度，上样量2～8mL，流速1mL/min，一般用水洗脱至少1个柱体积。本专利技术还提供按照本专利技术所述方法制得的猪苓菌核多糖，所述的猪苓菌核多糖为均一多糖，以葡萄糖和葡萄糖醛酸作为主要的结构单元，其中以葡萄糖构成的中性部分的重量百分含量为60.7％，以葡萄糖醛酸构成的酸性部分的重量百分比为24.2％，总糖的重量百分含量为84.9％，不含蛋白和核酸；该猪苓菌核多糖为均一多糖，平均分子量为290KDa，其结构是以1→6连接的β-D-葡萄糖为主链，以1→3连接的β-D-葡萄糖、1→4连接的β-D-葡萄糖、1→3连接的β-D-葡萄糖醛酸、1→4连接的β-D-葡萄糖醛酸、末端β-D-葡萄糖构成的支链取代于主链的O-3位置，其中主链上被取代的残基与未被取代的残基比为1:1。本专利技术提供的猪苓菌核多糖可用于制备抗氧化剂。本专利技术制备方法操作简单、易于控制，所用试剂为水和乙醇，安全无毒，成本低。本专利技术方法制得的猪苓菌核多糖具有抗氧化活性，可以清除DPPH自由基，抗氧化活性随着浓度的增大而增大。附图说明：图1实施例2制得的PUP60S2组分的HPGPC图。图2实施例2制得的PUP60S2组分的红外光谱图。图3实施例2制得的PUP60S2组分的DPPH清除率曲线图。具体实施方式：下面以具体实施例来对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1猪苓菌核多糖PUP60的提取称取干燥的猪苓菌核，经粉碎得到猪苓菌核粉末(过20目筛)，取1.0kg猪苓菌核粉末，加8.0L的体积分数96v％的乙醇浸泡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪苓菌核多糖的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)干燥的猪苓菌核，经粉碎得到猪苓菌核粉末，猪苓菌核粉末用体积分数95％‑100％的乙醇充分浸泡过滤，得滤渣；(2)步骤(1)所得的滤渣加蒸馏水，90‑100℃提取2‑4h，重复提取3～4次，过滤，合并所有的上清液，所得上清液A减压浓缩至原体积的1/10，得到浓缩液A；(3)向步骤(2)得到的浓缩液A中缓慢加入体积分数95％‑100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为30％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，得到沉淀I和上清液I，上清液I中缓慢加入体积分数95％‑100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为60％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，收集沉淀II，真空冷冻干燥，得到醇沉组分；(4)将步骤(3)得到的醇沉组分加蒸馏水溶解，离心，得上清液B，上样于阴离子交换柱，依次用水、0.1mol/L氯化钠水溶液、0.2mol/L氯化钠水溶液、0.4mol/L氯化钠水溶液进行梯度洗脱，苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖含量，收集0.2mol/L氯化钠水溶液洗脱下来的洗脱液，浓缩至所得浓缩液B中氯化钠浓度达到饱和，将浓缩液B上样于凝胶过滤色谱柱，用蒸馏水洗脱，苯酚硫酸法检测，收集含有多糖的洗脱液，浓缩、真空冷冻干燥后制得猪苓菌核多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种猪苓菌核多糖的制备方法，其特征在于所述的猪苓菌核多糖为均一多糖，平均分子量为290KDa，结构是以1→6连接的β-D-葡萄糖为主链，以1→3连接的β-D-葡萄糖、1→4连接的β-D-葡萄糖、1→3连接的β-D-葡萄糖醛酸、1→4连接的β-D-葡萄糖醛酸、末端β-D-葡萄糖构成的支链取代于主链的O-3位置，其中主链上被取代的残基与未被取代的残基比为1:1；所述方法包括以下步骤：(1)干燥的猪苓菌核，经粉碎得到猪苓菌核粉末，猪苓菌核粉末用体积分数95％-100％的乙醇充分浸泡过滤，得滤渣；(2)步骤(1)所得的滤渣加蒸馏水，90-100℃提取2-4h，重复提取3～4次，过滤，合并所有的上清液，所得上清液A减压浓缩至原体积的1/10，得到浓缩液A，所述蒸馏水的质量用量为猪苓菌核粉末的质量的10-20倍；(3)向步骤(2)得到的浓缩液A中缓慢加入体积分数95％-100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为30％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，得到沉淀I和上清液I，上清液I中缓慢加入体积分数95％-100％的乙醇，至乙醇终体积浓度为60％，4℃温度下静置8～12h，离心分离，收集沉淀II，真空冷冻干燥，得到醇沉组分；(4)将步骤(3)得到的醇沉组分加蒸馏水溶解，所述蒸馏水的体积用量以醇沉组分的质量计为0.1～0.2mL/mg，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：张安强，何鹏飞，孙培龙，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33