PEG-介导的核酸分子的组装制造技术

本发明专利技术公开了用于从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法。所述方法涉及使一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及拥挤剂接触以形成组装混合物。在一个实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇(PEG)。拥挤剂的存在促进本发明专利技术的核酸组装过程。随后使组装混合物经历多个循环，每一个循环包括退火期、延伸期和变性期，并且由此组装期望的核酸分子。在一些实施方案中，一个或多个时期随时间变化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】PEG-介导的核酸分子的组装 本申请要求2012年12月13日提交的美国临时申请序列号61/736, 946的权益， 所述美国临时申请在此通过引用以其整体（包括所有表、图和权利要求）并入。 专利
本专利技术涉及核酸分子的组装。本专利技术可应用于不同领域，诸如多种合成代谢途径 的构建、自动DNA组装以及大DNA片段的强劲工程等领域。 背景 本专利技术的背景的以下描述被提供来帮助理解本专利技术，但不被承认为或描述本专利技术 的现有技术水平。 合成基因构建应用于分子生物学的许多领域。DNA序列可以使用各种方法来组装。 这些方法一般涉及合成和扩增的两步骤过程，其中在第一步骤中使用用于寡核苷酸合成的 标准技术合成一组重叠寡核苷酸，并基于所述寡核苷酸的自引发（通过重叠区域之间的同 源性）组装所述重叠寡核苷酸。在第二步骤中，使用另外一对扩增全长基因产物的引物，将 组装的核酸进行PCR以扩增。一些可用的方法依赖于DNA聚合酶在组装过程中建立越来越 长的DNA片段。 其它核酸组装技术在原始基因组装混合物中包括扩增引物。这些方法一直以来是 无效的，只能够组装较小的基因，或不能组装具有挑战性核苷酸含量的核酸（诸如富含AT 或GC的序列）。 通常地核酸构建体的组装需要至少2个步骤：用于寡核苷酸的预组装的第一步 骤，和在单独的PCR步骤中扩增和组装预组装的产物的第二步骤。 有利的是具有用于组装核酸或基因，可在单个步骤中实现期望的核酸或基因的组 装和扩增的方法，并且所述方法还可合成比先前可用的核酸和基因的尺寸更大的核酸和基 因。还有利的是具有可在单个步骤中进行组装的方法。 概述 本专利技术公开了在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法。所述方 法涉及将一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及拥挤剂接触以形成组装混合 物。在一个实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇（PEG)。拥挤剂的存在促进本专利技术的核酸组 装过程。随后使组装混合物经历多个循环，每一个循环包括变性期、退火期和延伸期，并且 由此组装期望的核酸分子。在一些实施方案中，一个或多个所述时期随时间变化。可在单 个步骤中进行所述方法。 在一个方面，本专利技术提供了在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方 法。所述方法包括（a)使一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶、dNTP的混合物以及聚乙二醇接 触以形成组装混合物；(b)使所述组装混合物经历多个循环，每一个循环包括变性期、退火 期和延伸期，以及（c)由此在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子。 在一个实施方案中，寡核苷酸的组含有末端寡核苷酸和非末端寡核苷酸，并且在 组装混合物中以比非末端寡核苷酸高的浓度提供所述末端寡核苷酸。在一些实施方案中， 所述至少一个退火期发生在57°C至77°C的温度之间。每一个循环的延伸期可在时间上 相对于先前循环的延伸期得以增加。所述DNA聚合酶可以是热稳定性DNA聚合酶，诸如 PmJSIONli DNA聚合酶（Finnzymes，Oy，FI)。可将寡核苷酸的组组装成基因。在一些实 施方案中，所述聚乙二醇是PEG 8000。PEG的浓度可以是0.025% (w/v)或更大，或0.375% (w/v)或更大。退火期可发生在67°C，并且可将退火期和延伸期合并为单个时期。在各种 实施方案中，核酸分子的长度可大于lkb，或长度大于2kb，或长度大于3kb。重叠寡核苷酸 的组可具有至少5个寡核苷酸，或至少60个寡核苷酸，或至少75个寡核苷酸。 在一个实施方案中，所述核酸分子的长度大于2kb，起始延伸期为5分钟至7分钟， 并且随后延伸期是随时间变化的时期。在另一个实施方案中，核酸分子大于3kb，起始延伸 期为5分钟至7分钟，并且子序列延伸期在时间上相对于初始延伸期逐渐增加。寡核苷酸 的组可含有超过100个寡核苷酸。一个或多个时期可以是随时间变化的时期。在具体实施 方案中，所述延伸期是随时间变化的时期。所述延伸期可按约15秒/循环累计地延长，并 且所述多个循环为至少25个循环。所述核酸分子可具有一个或多个富含AT的序列。 上述本专利技术的概述是非限定性的，并且根据本专利技术的以下详述和根据权利要求， 本专利技术的其它特性和优势将是显而易见的。 附图详述 图IA提供了重叠寡核苷酸的图解说明，其中寡核苷酸A和B、B和C、C和D、D和 E以及E和F是重叠寡核苷酸，并且是反向相邻的寡核苷酸。图IB说明双链（ds) DNA片段 之间的同源性或重叠序列。 图2提供了一组基因 A的有空位和无空位的寡核苷酸的图解说明。 图3提供了显示根据本专利技术的方法从寡核苷酸组装2. 3kb基因（mutS)的凝胶的 说明。 图4提供了显示根据本专利技术的方法从寡核苷酸组装3. 7kb基因的凝胶的说明。 图5提供了显示根据本专利技术的方法从寡核苷酸组装富含AT的DNA的凝胶的说明。 图6提供了显示根据本专利技术的方法组装7个DNA片段以产生7kb分子的凝胶的说 明。 图7提供了显示根据本专利技术的方法从86个寡核苷酸组装mutS基因的凝胶的说 明。 图8A-B说明显示在本专利技术的系统中使用本专利技术的方法从各种流感病毒株组装核 酸构建体HA(H)和NA(N)的0. 8 %预制琼脂糖凝胶，每一个构建体从96个混合的寡核苷酸 组装而来。构建体HA和NA为大约3kb。图8A-泳道I :A/Brisbane/10/2010(HIN1)_HA ;泳道 2 :A/Brisbane/10/2010(H1N1)_NA ;泳道 3 :X179A_TD(H1N1)_HA ;泳道 4 :X179A(H1N1)_NA ; 泳道 5 :A/Victoria/361/2011_CDC/E3(H3N2)_HA ;泳道 6 :A/Victoria/361/2011 (H3N2)_ NA ;泳道 7 :A/Brisbane/256/2011_P2/E3(H3N2)_HA ;泳道 8 :A/Brisbane/256/2011_P2/ E3 (H3N2) _NA ;标准泳道。图 8B-标准泳道；泳道 I :B/Texas/06/2011_BX-45_HA ;泳道 2 :B/Texas/06/2011_BX-49_NA ;泳道 3 :B/New_Hampshire/l/2012_HA ;泳道 4:B/New_ Hampshire/1/2012_NA ;泳道 5 :B/Brisbane/60/08_HA ;泳道 6 :B/Brisbane/60/08_NA ;泳 道 7 :B/Nevada/03/2011_v2_HA ;泳道 8 :B/Nevada/03/2011_v2_NA。 专利技术详述 通过使用本专利技术的方法，可在单个步骤中实现期望的核酸分子的组装。因此根据 本专利技术，组装数百个寡核苷酸的必需时间和成本都得以下降。本专利技术从而有利于与多种合 成代谢途径的构建、自动DNA组装以及大DNA片段的强劲工程相关的目标。本专利技术部分地 基于以下发现，即在组装混合物中包含拥挤剂在核酸分子的组装中提供有益性质。在一个 实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇。不想受任何特定理论束缚，本专利技术人相信在组装混合 物中包含拥挤剂帮助互补寡核苷酸以更高的特异性彼此互补，从而增强核酸组装反应的稳 健性。 本专利技术利用在组装混合物中包含拥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装核酸分子的方法，所述方法包括：(a)使一组重叠寡核苷酸与DNA聚合酶；dNTP的混合物；和聚乙二醇；接触，以形成组装混合物；(b)使所述组装混合物经历多个循环，每一个循环包括一个或多个退火期、延伸期、变性期，(c)由此在单个步骤中从一组重叠寡核苷酸组装所述核酸分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·尤拉诺，D·G·吉布森，N·C·卡瓦扎，Z·齐，
申请(专利权)人：合成基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US