通过基因修饰信号传导蛋白提高藻类脂质生产力制造技术

本发明专利技术提供编码包含GAF结构域的多肽的基因表达减弱的突变微生物，其中与衍生其的野生型微生物相比，所述突变微生物具有更高的脂质生产力和/或表现出增加的碳与脂质分配。还提供使用所述突变微生物、引导RNA和用于产生突变微生物的核酸构建体产生脂质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过基因修饰信号传导蛋白提高藻类脂质生产力相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年12月5日提交的美国序列第62/594,930号的优先权，其全部内容通过引用以其整体并入本文。序列表的并入所附序列表中的材料特此通过引用并入本申请。名为SGI2120_1WO_序列表,txt的所附序列表文本文件创建于2018年11月19日，大小为34kb。可以在使用WindowsOS的计算机上使用MicrosoftWord访问该文件。
本专利技术涉及具有增加的脂质生产力的突变微生物，例如藻类和长短鞭毛体，以及它们用于生产脂质的方法。通过增加脂质生物合成来提高脂质生产力的各种尝试集中在操纵编码用于氮同化或脂质代谢的酶的基因或编码参与脂质储存的多肽的基因。例如，US2014/0162330公开了一种三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)藻株，其中硝酸还原酶(NR)基因已被基于RNAi的敲低减弱；Trentacoste等人((2013)《美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》110:19748-19753)公开了用靶向预计参与脂质分解代谢的Thaps3_264297基因的RNAi构建体转化的硅藻；并且WO2011127118公开了用编码油质蛋白(脂质存储蛋白)的基因以及编码二酰基甘油转移酶(DGAT)的基因转化衣藻属(Chlamydomonas)。尽管在每种情况下，基于显微镜或用亲脂性染料染色来确定脂质产生增加，但没有提供通过所操纵的细胞的定量脂质产生，也没有测定随时间的脂质生产力。Daboussi等人2014(《自然通讯(NatureComm.)》5:3881)报道了破坏三角褐指藻中的UGPase基因(其被认为是为海带多糖(一种贮藏碳水化合物)合成提供前体)，导致脂质积累增加。然而，没有生化数据展示表明海带多糖含量受到影响(或甚至存在)，并且没有报道脂质和生物质生产力。类似地，几个小组已经报道了衣藻属无淀粉突变体中脂质积累的增加(Wang等人，2009《真核细胞(EukaryoticCell)》8:1856-1868；Li等人2010《代谢工程(MetabEng.)》12:387-391)，然而，实际测量脂质生产力的连续报道的结论是这些藻株在光合自养条件下生长时生长受到损害(Siaut等人，2011《BMC生物技术(BMCBiotechnol.)》11:7；Davey等人2014《真核细胞(EukaryotCell)》13:392-400)。这些报告得出的结论是，野生型亲本藻株实际上实现了最高的脂质生产力(以每天每升TAG测量)。WO2011/097261和US20120322157报道了编码抑制蛋白的被称为“SN03”的基因在衣藻属中过表达时在营养充足的条件下具有增加脂质产生的作用。然而，观察到SN03基因的过表达导致未鉴定的极性脂质的出现，其未被定量，并且不导致甘油三酯(TAG)的增加。Boyle等人((2012)《生物化学杂(J.Biol.Chem.)》287:15811-15825)描述了另一种被鉴定为潜在调节应激诱导的脂质生物合成的多肽。在衣藻属中敲除编码“SQUAMOUSA”结构域多肽的NRR1基因导致在氮耗尽下的脂质生物合成相对于野生型细胞减少；然而，没有获得显示脂质产生增加的突变体。US2010/0255550建议在藻类细胞中过表达推定的转录因子(TF1、TF2、TF3、TF4和TF5)来增加脂质产生，但没有公开此类藻株。美国专利申请公开第US2017/005803号公开了编码包括锌Cys结构域的调节子的基因，当在包括硝酸盐的培养基中培养时，该基因的弱化导致突变藻类中脂质生产力增加。突变藻类在培养物中显示生长，以野生型细胞的至少80％的速率积累生物质，同时产生多达野生型祖代藻株两倍的脂质。美国专利申请公开第US2017/0121742号公开了突变藻类，其编码具有溴结构域和TAZ锌指结构域的多肽的基因表达减弱，所述突变藻类显示了相对于野生型藻类，脂质生产力提高并且生物质生产力的降低最小。
技术实现思路
在一方面，本文提供突变微生物，其编码多肽的基因表达减弱，所述多肽包括称为cGMP特异性磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶和转录激活因子FhlA(GAF)结构域的结构域，例如GAF2结构域(例如SEQIDNO：1)，在一些实施例中，当突变微生物和对照微生物在相同条件下培养时，其比对照微生物产生更多的脂质和/或相对于对照微生物表现出增加的碳与脂质分配。在一些实施例中，对照微生物是野生型微生物。在一些实施例中，突变微生物比对照微生物多产生至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％或至少约250％(例如，多25％、50％、100％、150％、200％或250％中的至少任一种)的脂肪酸甲酯可衍生的脂质(FAME脂质)。在一些实施例中，本文提供的突变微生物表现出比对照微生物的FAME/TOC比高至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约220％、至少约240％、至少约260％、至少约280％、至少约300％、至少约320％、至少约340％、至少约360％、至少约380％或至少约400％(例如，高50-400％)的FAME与TOC比。如上所述的基因的“减弱的表达”包括，例如，基因的表达降低，使得产生降低水平的(其可能是不可检测的水平)由所述基因编码的功能性多肽。表达减弱还包括其中产生突变(如缺失、截短或移码)多肽的表达，使得突变多肽相对于非突变多肽具有降低或改变的功能。表达减弱可以是编码多肽的基因突变的结果，或者可以是设计为降低编码多肽的基因表达的构建体，例如靶向基因的RNAi构建体的表达或递送的结果。在一些实施例中，通过传统诱变或通过基因工程技术产生突变微生物。在一些实施例中，突变微生物可以在编码包括GAF(例如GAF2)结构域的多肽的基因或影响其表达的基因中具有突变，与对照微生物中基因的表达水平相比，所述突变导致编码包括GAF结构域的多肽的基因的表达水平降低。在一些实施例中，使用诱导双链断裂的一种或多种试剂产生一种或多种突变。在一些实例中，所述试剂是大范围核酸酶、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)系统和/或Cas核酸酶。在一些实施例中，导致编码GAF结构域的基因的表达减弱的突变是插入突变。在一些实施例中，突变微生物是任何真核微生物，并且在说明性实施例中，突变微生物是长短鞭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变微生物，其编码包含GAF结构域的多肽的基因表达减弱，其中所述突变微生物：/na)比对照微生物多生产至少约25％的脂质；和/或/nb)相对于所述对照微生物，表现出增加的碳与脂质分配；/n当所述突变微生物和对照微生物在相同条件下培养时。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171205 US 62/594,9301.一种突变微生物，其编码包含GAF结构域的多肽的基因表达减弱，其中所述突变微生物：
a)比对照微生物多生产至少约25％的脂质；和/或
b)相对于所述对照微生物，表现出增加的碳与脂质分配；
当所述突变微生物和对照微生物在相同条件下培养时。


2.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述GAF结构域是GAF2结构域。


3.根据权利要求2所述的突变微生物，其中所述GAF2结构域与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。


4.根据权利要求2所述的突变微生物，其中所述GAF2结构域包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列或其保守变体。


5.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述多肽包含与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。


6.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述多肽包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列或其保守变体。


7.根据权利要求1所述的突变微生物，其中所述突变微生物包含针对长短鞭毛体或藻类物种中Naga_100020g79基因座或同线基因座中的基因或影响所述基因表达的一种或多种突变。


8.根据权利要求7所述的突变微生物，其中所述突变微生物包含针对包含开放阅读框的基因或影响包含开放阅读框的基因的表达的突变，所述开放阅读框与SEQIDNO:3具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。


9.根据权利要求7所述的突变微生物，其中所述一种或多种突变存在于以下核酸中或影响以下核酸的表达：编码包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸；和/或包含开放阅读框的核酸，所述开放阅读框包含与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列。


10.根据权利要求7所述的突变微生物，其中所述一种或多种突变在Naga_100020g79基因座中的基因的GAF结构域中。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的突变微生物，其中所述对照微生物是野生型微生物。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物比对照微生物多产生至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％或至少约250％的脂肪酸甲酯可衍生的脂质(FAME脂质)。


13.根据权利要求12所述的突变微生物，其中当在包含硝酸盐作为唯一氮源的培养基中培养时，所述突变微生物比对照微生物多产生至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％或至少约250％的脂肪酸甲酯可衍生的脂质(FAME脂质)。


14.根据权利要求12或13所述的突变微生物，其中所述突变微生物是藻类，并且当在光合自养条件下培养时，比对照微生物多产生至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％或至少约250％的FAME脂质。


15.根据权利要求12至14中任一项所述的突变微生物，其中所述微生物比对照微生物多产生至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％或至少约120％的贮存脂质。


16.根据权利要求15所述的突变微生物，其中所述贮存脂质是三酰基甘油酯(TAG)。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物表现出比所述对照微生物的FAME/TOC比高至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约220％、至少约240％、至少约260％、至少约280％、至少约300％、至少约320％、至少约340％、至少约360％、至少约380％或至少约400％的FAME/TOC比。


18.根据权利要求17所述的突变微生物，其中所述突变微生物表现出至少约0.35的FAME/TOC比。


19.根据权利要求1至18中任一项所述的突变微生物，其中脂质生产力通过分批、半连续或连续的生产力测定来确定。


20.根据权利要求1至18中任一项所述的突变微生物，其中所述相同条件包含在包含小于2mM铵的培养基中培养所述突变微生物和对照微生物。


21.根据权利要求20所述的突变微生物，其中所述相同条件包含在包含硝酸盐作为基本上唯一的氮源的培养基中培养所述突变微生物和对照微生物。


22.根据权利要求1至21中任一项所述的突变微生物，其中所述相同条件包含在相对于所述对照微生物富营养物的培养基中培养所述突变微生物和对照微生物。


23.根据权利要求1至22中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物是经典来源的突变或基因工程突变。


24.根据权利要求23所述的突变微生物，其中所述突变微生物在编码包含GAF结构域的多肽的基因或影响其表达的基因中具有突变，导致与所述基因在对照微生物中的表达相比，所述编码包括GAF结构域的多肽的基因的表达降低。


25.根据权利要求23所述的突变微生物，其中所述突变是敲低突变。


26.根据权利要求25所述的突变微生物，其中所述敲低突变是使用Cas/CRISPR系统产生的。


27.根据权利要求23所述的突变微生物，其中所述突变微生物包含靶向编码具有GAF结构域的多肽的基因或影响其表达的基因的RNAi构建体、核酶构建体或反义构建体。


28.根据权利要求24所述的突变微生物，其中所述突变微生物在编码包含GAF结构域的多肽的基因或影响其表达的基因中具有敲除突变。


29.根据权利要求28所述的突变微生物，其中所述敲除突变是通过位点定向同源重组产生的。


30.根据权利要求28或29所述的突变微生物，其中所述敲除突变通过部分或全部缺失、截短、移码或插入突变来破坏基因。


31.根据权利要求28至30中任一项所述的突变微生物，其中所述敲除突变是使用大范围核酸酶、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)系统和/或Cas/CRISPR系统产生的。


32.根据权利要求26、28、30或31中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物包含Cas/CRISPR介导的插入所述基因中。


33.根据权利要求1至32中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物包含至少一种另外的基因修饰，所述基因修饰赋予除草剂抗性、毒素抗性、增强的生长特性、增强的光合效率、增强的脂质产生或积累以及特定脂质的产生。


34.根据权利要求1至33中任一项所述的突变微生物，其中所述突变微生物是藻类或长短鞭毛体物种。


35.根据权利要求34所述的突变微生物，其中所述突变微生物是选自由以下组成的组的藻类物种：曲壳藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Aster...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·阿加维，
申请(专利权)人：合成基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US