ssl2084基因在合成中长链脂肪酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及ssl2084基因在合成中长链脂肪酸中的应用。一种在集胞藻中促进合成中长链脂肪酸的蛋白ssl2084，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还涉及ssl2084基因在合成集胞藻中长链饱和脂肪酸中的应用。本发明专利技术首次公开了集胞藻PCC 6803的ssl2084基因在低温下对合成中长链饱和脂肪酸合成的重要作用，通过在集胞藻PCC 6803中利用过表达方法增加ssl2084基因的表达，突变株中C12:0、C16:0和18:0的含量显著增加，同时经低温处理后，突变株中C12:0，C16:0，C18:0的含量进一步增加；这改变了本领域通常认为低温容易合成不饱和脂肪酸的认识。

The application of ssl2084 gene in the synthesis of medium and long chain fatty acids

【技术实现步骤摘要】
ssl2084基因在合成中长链脂肪酸中的应用
本专利技术涉及ssl2084基因在合成中长链脂肪酸中的应用，特别涉及集胞藻PCC6803中ssl2084基因在低温条件下合成集胞藻中长链饱和脂肪酸的应用，属于基因工程

技术介绍
脂肪酸是生物体基本组成之一，具有重要的生理功能。它们既是细胞膜脂的主要成分，又是重要的能源物质，还是一些信号分子的前体，可与其它物质一起分布于机体表面，防止机械损伤和热量散发等。此外它还与细胞识别、种特异性和组织免疫等有密切关系。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)是指含有两个以上双键且碳原子数为16～22的直链脂肪酸。是构成高等动、植物细胞的重要成分之一，对人体具有重要的生理功能，在营养学和医学领域有着重要作用。目前市场上的PUFAs仍无法满足人们的需求，且价格昂贵，存在潜在的污染问题进而影响生态可持续发展。多不饱和脂肪酸的合成以中长链饱和脂肪酸，特别是C12:0，C16:0，C18:0脂肪酸为原料基础。中长链饱和脂肪酸在脂肪酸去饱和酶的作用下，在特定部位产生双键，最终产生不饱和脂肪酸。因此增加中长链饱和脂肪酸的产量，可为多不饱和脂肪酸的合成奠定基础。蓝藻(cyanobacteria)是地球上出现最早的光合自养原核生物，是最重要的原初生产者之一，能适应多种环境。并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC6803(Synechocystissp.PCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用生物反应器大规模生产，是理想的蓝藻基因工程受体。如何提高微藻中的脂肪酸含量已成为广泛研究的热点。而随着代谢工程技术的发展及日趋成熟，通过改造、阻断及引入新的代谢途径来提高细胞内不饱和脂肪酸的含量，可以在提高目标产物得率的同时减少副产物的生成。在众多方法中，基因工程手段已被证明是一种非常有效的方法而受到世界各国科学家的青睐，有关微藻脂肪酸代谢相关的基因工程研究仍处在起步阶段。研究表明，微藻在胁迫条件下生长时细胞分裂速率下降、细胞生长变得缓慢、新物质的合成会逐渐停止，但作为一种保护机制，脂肪酸的合成得以持续并积累。在微藻脂肪酸代谢途径中，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvatedehydrogenase，pdh)的催化下氧化脱羧形成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoAcarboxylase，ACCase)的催化下生成丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)。丙二酰辅酶A在丙二酰CoA酰基载体蛋白转移酶催化下，与酰基载体蛋白(Acylcarrierprotein，ACP)结合，生成脂肪酸延长过程中碳链的供体丙二酰-ACP(Malonyl-ACP)。在脂肪酸合成酶(Fattyacidssynthase，FAS)的作用下，malony-ACP经过一系列反应，最终能形成脂肪酸(Fattyacids，FAs)，如图1所示。ACP位于脂肪酸代谢途径的中心，其能够与脂肪酸代谢途径中各种蛋白包括FabB、FabF、FabG、FabH和FabZ等发生相互作用。ACP作为载体蛋白大家族的一员，其三级结构极其保守。在细胞的新陈代谢过程中，ACP联系着各种重要的蛋白复合体酶系，它的主要功能就是将酰基链在不同酶的中心位点之间转运，同时可作为许多天然产物的酰基供体，与脂肪酸合成酶途径息息相关。研究发现ACP在细胞中初始主要以无活性的apo-ACP形式存在，通过特殊的翻译后修饰，在其高度保守的丝氨酸位点连接4’-磷酸泛酰基巯基乙胺辅基组，将起始无活性的apo-ACP转换为有活性的holo-ACP，从而发挥作用。研究表明，ACP不仅参与脂肪酸合成，还参与脂肪酸的不饱和反应；ACP能够依靠串联酰基载体蛋白形成的四元结构增强催化效果，提高不饱和脂肪酸的产量；将ACP的疏水残基用色氨酸替代可改变细胞内脂质组成，增加细胞内中链脂肪酸的含量。目前在集胞藻PCC6803中ACP和中长链脂肪酸合成中的作用研究还未有报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种ssl2084基因在合成中长链脂肪酸中的应用。本专利技术通过使用同源重组技术在集胞藻PCC6803中增加ssl2084基因的表达后，发现ssl2084基因过表达突变株中C12:0、C16:0和18:0的含量显著增加，分别为1.50mg/g、8.74mg/g和0.60mg/g，与野生型相比分别增加了54.71％、50.82％和155.86％。同时在低温(20℃)处理条件时，ssl2084基因过表达突变株中C12:0，C16:0，C18:0的含量进一步增加，分别达到1.70mg/g、11.85mg/g和2.31mg/g，与野生型相比分别提高了31.94％、47.35％和39.90％。本专利技术技术方案如下：一种在集胞藻中促进合成中长链脂肪酸的蛋白ssl2084，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种ssl2084基因在合成集胞藻中长链饱和脂肪酸中的应用，所述ssl2084基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述中长链饱和脂肪酸为C12:0、C16:0、C18:0饱和脂肪酸。根据本专利技术优选的，上述应用，通过构建过表达中长链脂肪酸的蛋白ssl2084的集胞藻工程菌，然后经扩大培养，诱导培养，提纯，制得中长链饱和脂肪酸。根据本专利技术优选的，所述集胞藻工程菌的构建过程如下：(1)以Pcpc560片段为启动子片段，与ssl2084基因进行基因融合，制得融合片段Pcpc560+ssl2084；所述Pcpc560的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(4)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段，与同样经KpnI内切酶酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285U；(5)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285U连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD；(6)将步骤(1)制得的融合片段Pcpc560+ssl2084经SalI、EcoRI内切酶酶切后，与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD连接，制得重组载体p5S1285UD-ssl2084；(7)用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Spe，回收壮观霉素抗性Spe片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在集胞藻中促进合成中长链脂肪酸的蛋白ssl2084，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种在集胞藻中促进合成中长链脂肪酸的蛋白ssl2084，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种ssl2084基因在合成集胞藻中长链饱和脂肪酸中的应用，其特征在于，所述ssl2084基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中长链饱和脂肪酸为C12:0、C16:0、C18:0饱和脂肪酸。


4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过构建过表达中长链脂肪酸的蛋白ssl2084的集胞藻工程菌，然后经扩大培养，诱导培养，提纯，制得中长链饱和脂肪酸。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述集胞藻工程菌的构建过程如下：
(1)以Pcpc560片段为启动子片段，与ssl2084基因进行基因融合，制得融合片段Pcpc560+ssl2084；
所述Pcpc560的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
(4)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段，与同样经KpnI内切酶酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285U；
(5)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285U连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD；
(6)将步骤(1)制得的融合片段Pcpc560+ssl2084经SalI、EcoRI内切酶酶切后，与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD连接，制得重组载体p5S1285UD-ssl2084；
(7)用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Spe，回收壮观霉素抗性Spe片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒p5S1285UD-ssl2084连接，制得质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD-Spe；
(8)将步骤(7)制得的重组载体pBluescriptSKT1T2-slr1285UD-Spe转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻。


6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，基因融合步骤如下：
初次融合反应体系如下：
分别取Pcpc560启动子片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈高，钟怀荣，路晓媛，戴美学，张燕，李国卫，游银伟，边斐，钟珂，罗泽宇，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37