一种蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及重组蓝藻抗病毒蛋白N的分离纯化。蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法，其特征在于提供一种能够高效表达可溶性重组蓝藻抗病毒蛋白N的菌株；具体方法如下：首先基于人工合成的cv‑n基因序列，利用PCR扩增技术得到cv‑n基因；其次通过pGEX‑4T‑1表达系统，构建含有CV‑N的表达载体；pGEX‑4T‑1表达系统在目的蛋白前会添加一段GST标签；最后表达宿主OrigamiB中利用IPTG诱导表达，得到可溶性高纯度的重组融合蛋白GST‑CV‑N。利用凝血酶切割GST标签，获得具有抗病毒活性的蓝藻抗病毒蛋白N。

Preparation and application of a cyanobacteria antiviral protein N

【技术实现步骤摘要】
一种蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及重组蓝藻抗病毒蛋白N的分离纯化。
技术介绍
蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N，CV-N)是一种从蓝藻中分离得到的一种水溶性糖蛋白，能够有效的抑制多种病毒的生长。CV-N包含101个氨基酸的独特序列。BEWLEY等人利用高分辨率核磁共振技术对溶解态CV-N的结构进行了研究，发现其大部分具有细长结构且内部为2倍假对称性的β片层的三级结构。[O’KeefeBR，SmeeDF，TurpinJA，etal.PotentAnti-InfluenzaActivityofCyanovirin-NandInteractionswithViralHemagglutinin[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy，2003，47(8)：2518.]研究发现其对多种病毒都具有有效的抗性。CV-N与在许多不同病毒表面上的甘露糖残基，包括人免疫缺陷病毒(HIV)的包膜糖蛋白gp120存在相互作用。另外有研究表明CV-N在抗病毒生物合成上也有重要作用，例如CV-N抗HSV-1作用靶位主要在于抑制感染细胞内病毒的生物合成。[刘宗涛，于红，尹延梅.重组蓝藻抗病毒蛋白N的纯化复性及其抗单纯疱疹病毒1型活性的研究[J].中国海洋药物(3)：4-8.]。早在CV-N发现之初，Boyd等利用人工合成的方法由CV-N序列和一段8肽的引导序列(AspTyrLysAspAspAspAspLys)连接而成的基因片段，经PCR扩增后克隆于pFLAG质粒上，构建成分泌型表达载体，并在E.Coli中诱导表达成功，以FLAG-CV-N融合蛋白的形式表达CV-N，但并未得到良好的可溶性表达[BoydMR，GustafsonKR，McmahonJB，etal.Discoveryofcyanovirin-N，anovelhumanimmunodeficiencyvirus-inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingp120：potentialapplicationstomicrobicidedevelopment[J].AntimicrobAgentsChemother，1997，41(7)：1521-1530.]。此后的几年中，研究的方向转向CV-N在真核细胞中的表达和纯化。在应用基因工程技术进行CV-N的重组及其在原核，真核中表达时他们发现，由于CV-N特殊的折叠方式，与其内部由半胱氨酸残基形成的两个二硫键和其表面潜的疏水结构，一方面保证了其稳定性，另一方面也致使其在克隆表达中大多存在包涵体，或者表达量低等问题[YangF，BewleyCA，LouisJM，etal.Crystalstructureofcyanovirin-N，apotentHIV-inactivatingprotein，showsunexpecteddomainswapping.[J].JournalofMolecularBiology，1999，288(3)：403-412.]。OrigamiB(DE3)菌株包含突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase)(trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase)(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性[ChantarangseeM，TanthanuchW，FujimuraT，etal.Molecularcharacterizationofβ-galactosidasesfromgerminatingrice(Oryzasativa)[J].PlantScience，2007，173(2)：118-134.]。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，可同时表达T7RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达，具有卡那霉素和四环素抗性。利用OrigamiB(DE3)菌株作为表达的寄主细胞，帮助蛋白正确折叠。能够有效提高蛋白的表达量，减少包涵体的生成等优点。
技术实现思路
为了克服现有的表达产量不高，容易形成包涵体等问题，本专利技术旨在提供一种能够高效表达可溶性重组蓝藻抗病毒蛋白N的菌株。本专利技术的另一目的是利用上述菌株建立高效表达重组蓝藻抗病毒蛋白N的方法。本专利技术的最后目的是利用上述菌株/蛋白应用于制备抗病毒药物。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下。本专利技术首先基于人工合成的cv-n基因序列，利用PCR扩增技术得到cv-n基因。本专利技术其次通过pGEX-4T-1表达系统，构建含有CV-N的表达载体。pGEX-4T-1表达系统在目的蛋白前会添加一段GST标签。本专利技术进一步提供了包含其表达载体的宿主细胞OrigamiB(DE3)得到了高纯度的重组蛋白。通过对GST标签的巧妙应用得到纯化的GST-CV-N。并且利用凝血酶对GST标签的特异性切割，得到纯化的蓝藻抗病毒蛋白N。有益效果GST标签的特异性吸附，简化了下游纯化步骤，并且在特异性蛋白酶的帮助下得到不带标签的CV-N。凝血酶相对于其他标签酶价格低廉。重组可溶性表达蛋白GST-CV-N占总蛋白比例较高达到45％，较已有的方法而言大大的提高了可溶性蛋白的比例。经分离纯化和GST标签切除后1L的发酵产物可以得到12.4±0.5mgCV-N。附图说明图1是PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳的结果。其中M：DNAmarker15000，1：cv-n基因。图2是pGEX-4T-1-cv-n质粒的结构示意图。图3是重组质粒pGEX-4T-1-cv-n质粒通用引物鉴定的结果。其中M：DNAmarker15000，1：重组质粒pGEX-4T-1-cv-n作为模板，2：pGEX-4T-1作为模板。图4为重组质粒T-cv-n测序鉴定图。图5是重组质粒pGEX-4T-1-cv-n测序鉴定图。图6是CV-N诱导表达纯化图。M：蛋白marker，1：对空载pGEX-4T-1的诱导。2：重组蛋白的诱导前，3：GST-CV-N诱导后上清，4：GST-CV-N诱导后沉淀，5：GST-CV-N蛋白上清纯化后。图7是利用免疫印迹技术鉴定融合蛋白GST-CV-N。图8GST-CV-N标签的切割，得到不带有标签的蓝藻抗病毒蛋白N。M：蛋白marker，1：纯化后的GST-CV-N，2：GST-CV-N.用凝血酶切割后，3：CV-N蛋白纯化后。图9高效液相色谱鉴定CV-N纯度。图10CV-N对Hepg2.215细胞毒性鉴定。图11通过对HBV的pgRNA的测定检测重组CV-N的抗病毒活性。具体实施方法本专利技术主要材料如下：携带cv-n基因的PUC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法，其特征在于提供一种能够高效表达可溶性重组蓝藻抗病毒蛋白N的菌株；具体方法如下：/n(1)基于人工合成的cv-n基因序列，利用PCR扩增技术得到cv-n基因；/n(2)通过pGEX-4T-1表达系统，构建含有CV-N的表达载体；pGEX-4T-1表达系统在目的蛋白前会添加一段GST标签；/n(3)表达载体在宿主细胞OrigamiB表达得到了高纯度的重组蛋白；/n(4)利用凝血酶切割GST标签后得到在N端比天然蓝藻抗病毒蛋白N多了2个氨基酸的重组蓝藻抗病毒蛋白N。/n

【技术特征摘要】
1.蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法，其特征在于提供一种能够高效表达可溶性重组蓝藻抗病毒蛋白N的菌株；具体方法如下：
(1)基于人工合成的cv-n基因序列，利用PCR扩增技术得到cv-n基因；
(2)通过pGEX-4T-1表达系统，构建含有CV-N的表达载体；pGEX-4T-1表达系统在目的蛋白前会...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧瑜，彭雯，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32