一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三碳化合物的方法，是将三碳化合物合成途径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，扩大培养基因工程蓝藻生产三碳化合物如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1,3-丙二醇、d-甘油酸和羟基丙酮酸。本发明专利技术所述的方法避免了生物质资源高成本的收集、处理和分解过程，直接使用廉价原料CO2作为碳源，生产应用广泛的化学品和燃料，可以减少大气中CO2的排放，具有推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其涉及一种利用基 因工程蓝藻直接转化CO 2生产三碳化合物的方法。
技术介绍
三碳化合物，如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、d-甘油酸和羟基丙酮酸 等，在化工、材料、医药和纺织等工业中具有广泛的用途，可作为化学合成和生物催化的原 料用于生产各种化学品和燃料等高值产物。二羟基丙酮广泛用于化妆品工业中，其在化学 品和生物材料合成中也有着广泛的应用；3-羟基丙酸是美国能源部筛选的最具前景的12 种平台化合物之一，可用于合成丙烯酸、丙二酸等多种化学品，其自聚物聚3-羟基丙酸是 一种新型的生物降解性塑料；1，3-丙二醇可用于多种药物、医药中间体和聚合物（如聚对 苯二甲酸丙二醇酯，又称PTT)的合成，市场需求量大；d-甘油酸是在植物中发现的一种生 物活性物质，其与其的衍生物具有重要的药用价值，d-甘油酸同时也可用作表面活性剂和 聚合单体。基于可持续发展的需求，生物转化可再生生物质资源生产三碳化合物受到越来 越多的关注。但是，生物质资源的收集、处理、分解等过程耗时且成本高。 蓝藻（Cyanobacteria)又称蓝细菌，是可以进行光合作用的原核生物，其分布十 分广泛，大多数为淡水产，少数海产。蓝藻生长快速，具有高效的〇) 2固定效率，且遗传背景 简单，易于进行遗传操作，部分蓝藻已具有成熟的遗传操作体系。目前已有基因工程改造蓝 藻生产乳酸、丙酮、丁醇、乙醇和氢气等化学品和燃料的报道。但是，目前还没有使用基因工 程蓝藻直接转化〇) 2生产重要三碳化合物如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、d-甘油 酸和羟基丙酮酸的相关报道。 因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三 碳化合物的方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三 碳化合物的方法。本专利技术所述的方法避免了生物质资源高成本的收集、处理和分解过程，直 接使用廉价原料〇) 2作为碳源，可以减少大气中CO 2的排放，具有重要的应用价值。 本专利技术提供的，具体为，将三碳化 合物合成途径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，扩大培养基因工程蓝藻生产 三碳化合物。 进一步地，上述三碳化合物包括二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、D-甘油酸 和羟基丙酮酸。 进一步地，上述三碳化合物为二羟基丙酮，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因和甘油脱氢酶的编码基因； 或者上述三碳化合物为3-羟基丙酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醛脱氢酶的编码基因； 或者上述三碳化合物为1，3_丙二醇，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因； 或者上述三碳化合物为d-甘油酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷 酸酶的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因； 或者上述三碳化合物为羟基丙酮酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因、过氧化氢酶的编码基因和甘油酸氧化 酶的编码基因。 其中，在基因工程蓝藻中，各个基因是串联表达，且串联结构含有启动子，优选地， 启动子为Ptrc启动子，序列如SEQ ID NO. 9。 进一步地，甘油-3-磷酸酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列杂交，并 且编码具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白质，其中上述甘油-3-磷酸酶的编码基因来源于酿 酒酵母； 甘油脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 2的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱氢酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱氢酶的编码基因来源于肺炎克雷伯氏菌； 甘油脱水酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 3的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱水酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱水酶的编码基因来源于丁酸梭菌； 醛脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 4的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醛脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 醇脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 5的核苷酸序列杂交，并且编码具有醇脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醇脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 醛醇氧化酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 6的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛 醇氧化酶活性的蛋白质，其中所述醛醇氧化酶的编码基因来源于链霉菌； 过氧化氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 7的核苷酸序列杂交，并且编码具有过 氧化氢酶活性的蛋白质，其中所述过氧化氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 甘油酸氧化酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 8的核苷酸序列杂交，并且编码具有 甘油酸氧化酶活性的蛋白质，其中所述甘油酸氧化酶的编码基因来源于假单胞菌。 进一步地，蓝藻选自聚球藻属、集胞藻属、念珠藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、球藻属、 颤藻属、阿格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属中的一种，优选为聚球藻属，最优选为细长聚球藻 PCC 7942。 进一步地，本专利技术提供的，包括以 下步骤： 1)将要转化到蓝藻中的基因与Ptrc启动子一同连接到重组质粒，将重组质粒转 化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻； 2)将步骤（1)中的基因工程蓝藻接种到BGll液体培养基中，30°C光照培养7-10 天，制得种子； 3)将步骤⑵中制得的种子接种到新鲜BGll液体培养基中进行扩大培养，30°C光 照培养2-3天至OD 73tol达到0. 5-0. 6,加入IPTG诱导基因表达，继续光照培养10-20天，得 到含有相应产物的培养液； 4)将步骤⑶中制得的培养液收集，12, OOOXg离心5分钟，取上清，使用液相色 谱仪检测样品的含量。 进一步地，上述步骤⑴~⑶中上述的BGll培养基配方为： BGll 母液：梓檬酸铁铵溶液（6g/L) :Na2C03溶液（20g/L) :K2HP04溶液（30. 5g/L): 蒸馈水的体积比为：1〇 :1 :1 :1 :987,配制完成后121 C灭囷20分钟； 进一步地，上述 BGll 母液的配方是：149. 6g NaNO3, 7. 5g MgSO4 · 7H20, 3. 6g CaCl2 ·2Η20,0. 6g 柠檬酸，I. 12mL 0. 25M NaEDTA 溶液（pH 8. 0)，IOOmL 微量元素溶液，蒸馏 水定容至1L。 进一步地，BGll 微量元素溶液的配方是：2. 86g H3BO3,1. 81g MnCl2 · 7Η20,0· 22g ZnSO4 · 7Η20,0· 39g Na2MoO4 · 2Η20,0· 079g CuSO4 · 5Η20,0· 049g Co(NO3)2 · 6H20,蒸馏水定 容至1L。 进一步地，上述步骤（I) (2) (3)中所述的光照培养为100 μΕ ·πΓ2光强度下连 续光照，并连续通入5%体积比CO2气体。 进一步地，上述步骤（3)中，IPTG的终浓度为0. 1-2. OmM，优选的，IPTG终浓度为 ImM0 进一步地，上述步骤⑷中，所用液相色谱仪的型号为Agilent 1200系列 Hewlett - Packard，检测器为紫外检测器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在于，将三碳化合物合成途径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，通过扩大培养基因工程蓝藻生产三碳化合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，王钰，陶飞，唐鸿志，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31