一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA及其表达菌株和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r‑AofleA及其表达菌株和应用，其中真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r‑AofleA具有下列氨基酸序列之一：(1)序列表中的SEQ ID No：1；(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；(3)与序列表中的SEQ ID No：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。本发明专利技术重组岩藻糖特异性凝集素r‑AofleA对游离岩藻糖具有强的结合亲和力，其解离常数Kd值为0.015μM，在糖芯片上大于等于0.1μg/ml浓度即显示结合信号，适用于AFP‑L3％的检测。

Recombinant fucose specific lectin r-aoflea from fungi and its expression strain and Application

【技术实现步骤摘要】
一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA及其表达菌株和应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA及其表达菌株和应用。
技术介绍
N-聚糖的岩藻糖基化是整个真核生物界常见的一种分子修饰现象，在多种细胞的生理病理进程中起重要作用，包括信号传导、细胞粘附、受精和细胞生长等等(Aplin&Jones,2012；Becker&Lowe,2003；Ma,Simala-Grant,&Taylor,2006)。N-聚糖的岩藻糖基化种类比较复杂，包括不同种类的糖苷键以及不同数量的岩藻糖残基，这些变化取决于生物体以及细胞的生理与病理状态(Vainauskasetal.,2016)。例如，以α-1,6-糖苷键连接的岩藻糖残基经常在N-聚糖的核心壳聚二糖最内部的GlcNAc残基上出现，称为“核心”岩藻糖；而大部分岩藻糖以α1,2-，α1,3-或α1,4-糖苷键与半乳糖残基连接，存在于N-聚糖的外臂上(Vainauskasetal.,2016)。研究表明，在多种不同的病理状态下，例如肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌中，可以观察到核心岩藻糖基化水平的显著改变(Holst,Wuhrer,&Rombouts,2015；Mehta,Herrera,&Block,2015；Takahashietal.,2016)。以肝癌为例，临床证据表明，与其他肝脏疾病比较，肝细胞癌(HCC)产生一种核心岩藻糖基化的甲胎蛋白异质体(AFP-L3)。相应地，患者血液中的岩藻糖基化指数(AFP-L3％)升高。AFP-L3是一类对LCA凝集素具有高结合亲和力的AFP组分，已经成为HCC临床诊断的分子标志物之一(Choietal.,2013；Huang,Shyu,Turner,Chen,&Chen,2013；Li,Mallory,&Satomura,2001)。因此，检测临床样品中N-聚糖岩藻糖基化的改变水平具有重要的理论和临床意义，可以作为某些疾病(如肝细胞癌)潜在的诊断手段和预后指标(Zhangetal.,2016)。目前，凝集素是检测岩藻糖基化程度的主要分子探针，它们可以识别核心岩藻糖基化和外臂岩藻糖基化，可以对各种细胞生理病理过程中(如肝细胞癌)岩藻糖基化进行高度特异性检测和定量测定(Vainauskasetal.,2016)。迄今为止，已经有若干种凝集素在科研中或临床上得到了初步应用，例如使用真菌凝集素AAL和植物凝集素LCA来检测血清岩藻糖基水平用于肝细胞癌的诊断。虽然如此，由于岩藻糖基化与临床上各种疾病的紧密相关性，开发新的岩藻糖特异性凝集素，使其可以识别不同聚糖的岩藻糖键，尤其是可以识别N-聚糖中的核心岩藻糖基化，仍然是科研与临床上亟需的。开发这些具有不同岩藻糖结合特性的新型凝集素，将构成新的分子探针工具箱，利用这些新的分子探针可以更好地了解真核生物细胞内核心N-聚糖岩藻糖基化的生物学功能，或者用于筛选或检测针对特定疾病的聚糖类或糖蛋白类生物标记物(Vainauskasetal.,2016)。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA及其表达菌株和应用。真菌已成为新型凝集素的丰富来源，真菌凝聚素具有独特的碳水化合物结合特性。本专利技术首次以捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra为出发材料，研发了真菌来源的岩藻糖特异性凝集素的AofleA及其重组制备方法，建立了不同样品中甲胎蛋白异质体L3(一种HCC的生物标志物)相对含量(AFP-L3％)的检测方法。本专利技术真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA，其原始来源是捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，其特征在于它是由343氨基酸组成，分子量为38.1KDa，等电点为6.15，具有下列氨基酸序列之一：(1)序列表中的SEQIDNo：1；(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；(3)与序列表中的SEQIDNo：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。编码所述重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的编码基因，具有如下核苷酸之一：(1)序列表中的SEQIDNo：2；(2)序列表中的SEQIDNo：2经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQIDNo：1蛋白质序列的多核苷酸序列；(4)与序列表中的SEQIDNo：2具有80％以上同源性的突变核苷酸序列。本专利技术重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的重组表达菌株，其分类命名为：大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-AofleA(EscherichiacoliBL21(DE3)pET28a-AofleA)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年10月8日，保藏编号：CCTCCNO：M2019774。所述重组表达菌株的制备方法，首先采用合适的引物P1和P2通过RT-PCR对r-AofleA基因进行分子克隆，制备克隆载体pUC19-AofleA；然后通过NcoI和NotI限制性内切酶将AofleA基因连接到表达载体上，制备重组表达载体；随后将重组表达载体转化表达宿主，获得可重组表达r-AofleA的工程菌株。所述引物P1的核苷酸序列为SEQIDNo：3，所述引物P2的核苷酸序列为SEQIDNo：4。所述表达载体为pCold、pET15、pET22、pET28或pET30等。所述表达宿主为E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α或E.coliRosetta等。所述表达载体优选为pET28a，所述表达宿主优选为大肠杆菌BL21(DE3)。通过上述重组表达菌株制备重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的方法，包括如下步骤：步骤1：将所述重组表达菌株接种到含卡那霉素LB培养基中，于温度37℃、220rpm摇床震荡培养8-12h；步骤2：将步骤1获得的菌液取4ml转接到100ml-5LLB/Kan液体培养基中，优选300mlLB/Kan液体培养基，生长至OD＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mMIPTG，在16℃、220rpm摇床上诱导培养18h；步骤3：取步骤2获得的培养液5500g，4℃下离心10min，收集菌体并重悬于含有25mmol/LTris-HCl(pH8)、10mmol/L咪唑和0.5MNaCl的缓冲液中；步骤4：超声处理破碎细胞，10,000g，4℃离心40min，将获得的上清液加到NiNTA-agarose亲和柱上，用20mmol/L咪唑缓冲液(含0.5MNaCl，25mmol/LTris-HCl，pH8)洗涤杂蛋白；步骤5：用40-500mmol/L咪唑缓冲液分级洗脱目的蛋白，优选用10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA，其特征在于：/n所述重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的原始来源为捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，其具有下列氨基酸序列之一：/n(1)序列表中的SEQ ID No：1；/n(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；/n(3)与序列表中的SEQ ID No：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种真菌来源的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA，其特征在于：
所述重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的原始来源为捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，其具有下列氨基酸序列之一：
(1)序列表中的SEQIDNo：1；
(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；
(3)与序列表中的SEQIDNo：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA，其特征在于：
所述重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA是由343氨基酸组成，分子量为38.1KDa，等电点为6.15。


3.编码权利要求1或2所述的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的编码基因，其特征在于具有如下核苷酸之一：
(1)序列表中的SEQIDNo：2；
(2)序列表中的SEQIDNo：2经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)编码序列表中SEQIDNo：1蛋白质序列的多核苷酸序列；
(4)与序列表中的SEQIDNo：2具有80％以上同源性的突变核苷酸序列。


4.一种权利要求1或2所述的重组岩藻糖特异性凝集素r-AofleA的重组表达菌株，其特征在于：
所述重组表达菌株的分类命名为：大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-AofleA，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年10月8日，保藏编号：CCTCCNO：M2019774。


5.权利要求4所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于：
首先采用合适的引物P1和P2通过RT-PCR对r-AofleA基因进行分子克隆，制备克隆载体pUC19-AofleA；然后通过NcoI和NotI限制性内切酶将AofleA基因连接到表达载体上，制备重组表达载体；随后将重组表达载体转化表达宿主，获得可重组表达r-AofleA的工程菌株。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王永中，田东蕊，张丽，孔小卫，盛康亮，汪静敏，张敏，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34