【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种线粒体靶向的近红外荧光探针及其制备方法和在羧酸酯酶检测中的应用，以实现对活细胞线粒体内羧酸酯酶的近红外荧光成像，具有选择性专一、检测高效灵敏、生物相容性良好的优点。
技术介绍
1、作为生命的基本单位，细胞是执行各种生物活动的巧妙而复杂的化学机器，用于执行各种不同的生物活动。细胞内存在的各种生物小分子和大分子，相互协调执行多种生物学功能。酶是最重要的细胞内的一类关键大分子，在正常生活至关重要的各种催化反应。羧酸酯酶(carboxylesterases，ces)是一种丝氨酸水解酶，广泛存在于多种生物系统中，可以内源性和外源性催化酯、硫酯、酰胺和氨基甲酸酯的酯交换和水解。作为重要的i期外源性代谢酶，ces的缺乏或异常调节与沃尔曼病、胰岛素不敏感、肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化、肝脂肪变性和肝细胞癌等人类疾病直接相关。这些酶因其高催化转化率和广泛的底物特异性，不仅广泛用于解毒和抗外源性药物，还广泛用于某些前药的代谢激活以及药物靶点。监测线粒体酯酶活性不仅对研究线粒体代谢，而且对评估线粒体靶向前药的有效性也至关重要。因此，检测线粒体羧酸酯酶活性具有重大意义。
2、目前，由于制备简单、灵敏度超高、选择性高和活生物体成像能力，已经开发出许多用于羧酸酯酶(ces)检测的荧光探针。然而，由于线粒体中酯酶的普遍存在和荧光探针的不受控制的定位，已开发的准确检测线粒体酯酶活性的荧光探针还很少。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种线粒体靶向的近红外荧光探针及其制备方法和在羧
2、本专利技术线粒体靶向的近红外荧光探针，简记为syh-sf，以氧杂蒽衍生物为母体，其结构式如下所示：
3、
4、本专利技术荧光探针syh-sf结构中的吡啶阳离子与氧杂蒽衍生物相连，形成的供体-受体(d-π-a)结构，有利于荧光到近红外发射区和较大的斯托克斯位移，同时使探针可以定位线粒体。在活细胞线粒体中与羧酸酯酶响应后，探针syh-sf荧光增强，同时探针还对ces表现出高的灵敏度和选择性，测试使用的是cas号为9016-18-6的羧酸酯酶。
5、本专利技术线粒体靶向的近红外荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
6、步骤1：将30mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)与10ml二氯甲烷(dcm)混合，在0℃下滴加三溴化磷，移出冰水浴滴加环己酮，反应六小时后将反应液滴加至150ml水中，再用碳酸钠调中性，以水和dcm萃取，旋干得中间体1。
7、步骤2：将9.4g中间体1、5.3g 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、17g碳酸钾加入到30mldmf中反应12h，再用水和dcm萃取，旋干，打浆(乙酸乙酯：石油醚＝1:1，v/v)，抽滤得中间体2。
8、步骤3：将1.9g中间体2加入到20mldcm中，在0℃下滴加三溴化硼，室温反应4h，25ml dcm稀释，再加20mldcm和20ml水萃取，旋蒸得中间体3。
9、步骤4：将3.0g碘甲烷和2.0g四甲基吡啶加入到10ml乙腈中，常温搅拌2h，直接抽滤得中间体4。
10、步骤5：将1g中间体3、1.03g中间体4和两滴哌啶加入到10ml乙醇中，80℃回流12h，旋干溶剂，乙酸乙酯打浆，然后柱层析分离(甲醇：二氯甲烷＝1:20，v/v)得中间体syh-oh。
11、步骤6：将0.1g中间体syh-oh、0.5ml三乙胺加入到5mldcm中，在0℃下滴加33mg2-噻吩甲酰氯，室温下反应2h，旋干溶剂，柱层析分离(甲醇：二氯甲烷＝1:20，v/v)得目标产物syh-sf。
12、合成路线如下所示：
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14、本专利技术线粒体靶向的近红外荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
15、所述检测试剂能够用于成像细胞中内源性和外源性羧酸酯酶、抗癌药物的评价以及区分癌细胞与正常细胞。
16、检测方法如下：
17、将本专利技术syh-sf溶于dmso中制得2mm的母液，各取15μl母液于3ml不同含量羧酸酯酶的dmso/pbs缓冲溶液(ph＝7.4，2：8，v:v)溶剂中，获得10μm syh-sf在不同测试液中的荧光和紫外谱图。随着羧酸酯酶含量的增多，syh-sf的吸光度在530nm处升高，以530nm作为激发波长，荧光在645nm处上升，表明其具有近红外成像能力。接着通过mtt(5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物)方法进行了暗细胞毒性实验。syh-sf在活hepg2细胞中加入各种浓度(0μm，5.0μm，10.0μm，15.0μm，20.0μm)，在黑暗中孵育24小时后测试，细胞的活力没有影响。探究syh-sf在细胞中羧酸酯酶的成像能力，对加入syh-sf的细胞进行了不同时间的监测，红色通道荧光没有发生变化。以上结果为表明syh-sf在细胞中可稳定成像。探究syh-sf在细胞中羧酸酯酶检测能力，对样品加入羧酸酯酶抑制剂，对照组不加抑制剂，样品组的红光发射减弱。以上结果表明，在细胞内syh-sf在可以对羧酸酯酶进行内源性检测。检查探针syh-sf的潜在药物筛选能力，对样品组加入抗癌药物sorafenib，对照组不加药物，样品组红光发射减弱。结果表明，探针syh-sf有潜力根据靶向ce筛选药物。探究syh-sf识别癌细胞与正常细胞的能力，将syh-sf(10μm)在癌细胞(hepg2，4t1)和正常细胞(3t3，mh-s)共同孵育培养，然后进行共聚焦荧光成像。共聚焦图像荧光强度表明癌细胞组红光发射较强，正常细胞组红光发射较弱。结果说明探针syh-sf可以区分癌细胞与正细胞。
18、本专利技术通过近红外荧光检测，以实现对细胞中羧酸酯酶荧光成像。具有稳定的荧光成像能力，细胞毒性测试表明syh-sf的细胞相溶性良好，共聚焦荧光显微成像实验表明syh-sf可以定位线粒体并对羧酸酯酶进行近红外荧光成像、有评价抗癌药物作用的潜力，同时还可以区分癌细胞与正常细胞。
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1.一种线粒体靶向的近红外荧光探针，其特征在于其结构式如下所示：
2.权利要求1所述线粒体靶向的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
3.权利要求1所述线粒体靶向的近红外荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向的近红外荧光探针，其特征在于其结构式如下所示：
2.权利要求1所述线粒体靶向的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，许孪孪，王奇，冯燕，王宸元，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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