在本发明专利技术的一个方面，提供了末端标记ＲＮＡ（总ＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ或片段化的ＲＮＡ）的方法。在本发明专利技术的一个方面，Ｔ４ＲＮＡ连接酶用于将３’－标记的ＡＭＰ或ＣＭＰ供体连接于ＲＮＡ受体分子。在另一实施方案中，焦磷酸分子３′－ＡｐｐＮ－３′－接头－可检测部分被用作供体分子。在本发明专利技术的另一个方面，提供了检测样品中目的ＲＮＡ的存在的方法，方法具有下列步骤：提供含有可能或可能不具有所述目的ＲＮＡ的ＲＮＡ的样品；用片段化试剂处理样品来提供ＲＮＡ片段；由所述片段除去磷酸基来提供具有游离３′ＯＨ基团的片段；连接具有本发明专利技术标记试剂的所述片段；提供具有针对所述目的ＲＮＡ的探针的核酸阵列；将标记的核酸片段杂交于所述核酸阵列；以及测定所述探针的杂交程度来测定所述目的ＲＮＡ的存在。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸标记化合物。这些标记化合物具有可检测的部分或一些部分，其是允许通过合适的设备或试验检测携带其的RNA或其片段的分子或复合体。具体地，本专利技术涉及可用于标记RNA分子或片段的3′末端的核酸标记化合物。本专利技术的核酸标记化合物可通过使用称作RNA裂解酶的酶连接于RNA。这种标记方法据说是用于使其从需要转化RNA为DNA的其它方法中区分开。本专利技术也涉及利用核酸微阵列对标记的RNA进行的分析。
技术介绍
在病态和健康细胞中以及在在不同发育阶段的细胞中的基因表达通常是不同的。在此情况下监控基因表达的能力给研究人员和医务工作者提供了强有力的诊断工具。人们例如可以通过测定目的基因的转录产物也即核酸(例如，mRNA)的存在与否监控基因表达。可通过用可检测部分化学或生物化学标记mRNA然后与基因的核酸探针杂交来完成对核酸的监控。在探针位置检测标记的核酸表明靶基因已经表达。现在已经发展了多种RNA检测方法。这些包括“Northern”印迹以及利用放射性同位素诸如32P。也已经开发了非放射性检测技术。Langer等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 1981，6633-6637，例如，公开了特定生物素标记的核苷。Lockhart等的美国专利6,344,316，公开了用非放射性核苷酸标记末端的酶催化法。这些参考文献在这里引入作为参考。然而，仍需要其可用于有效以及精确的标记RNA和监控基因表达的RNA标记化合物。专利技术概述在本专利技术的一个方面，提供了可用于将可检测部分连接到RNA分子或其片段的3′末端上的化合物。在本专利技术的一个方面，提供了下式化合物 其中B是杂环的碱基部分；X是允许核酸标记化合物连接于RNA分子或RNA片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或卤素；L是接头基团；且Sig是可检测的标记或部分。在本专利技术的另一方面，提供了下式核酸标记化合物 其中L是接头且Sig是可检测的部分；B1是腺嘌呤且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。在本专利技术的另一个方面，化合物具有诸如下式的多重信号源 其中B是杂环的碱基部分，L1是第一接头，L2是第二接头，Sig是可检测部分且n是从1到6的整数。在本专利技术的另一方面，提供了末端标记RNA(总RNA，mRNA，cRNA或片断RNA)的方法。在一个实施方案中，T4RNA连接酶用于将3’-生物素化的AMP或CMP供体连接于RNA受体分子。在另一实施方案中，3′-APPN-3′-接头-生物素型的焦磷酸盐被用作供体分子被连接于RNA受体分子。在本专利技术的另一个方面，提供了分析核酸微阵列上的核酸群的方法，包括提供核酸群或将核酸群转化为核酸片段；利用连接酶将核酸群或片段连接于核酸标记分子来形成标记的核酸群或片段；将标记的核酸群或片段杂交于一系列核酸探针，并且测定探针的杂交信号来显示核酸群中核酸的水平。 附图说明图1基于各自四个重复，比较重复末端-标记的(平均连接)与内部-标记的cRNA(平均标准)。通过连接进行的末端标记与内部-标记的cRNA相比产生更大量的信号和更高的靶强度(如通过平均平均差异测定的)。专利技术详述本专利技术具有很多优选的实施方案并且依赖于许多本领域公知的专利申请及其它参考文献。因此，当以下引用或重复提及专利，申请或其它参考文献时，应能理解其被通过引入作为参考用于所有目的以及用于所列举的问题。如在此申请中使用的，单数形式的“a”，“an”，和“the”包括复数含义，除非上下文中清楚地说明。例如，术语“药物”包括大量的药物，包括其混合物。个体不限于人，也可以是其它生物体包括但不限于哺乳动物，植物，细菌，或来源于任意上述的细胞。在此公开中，本专利技术的不同方面可以是范围形式。应能理解范围形式的描述仅仅是为方便和简短起见并且不应理解为对本专利技术范围呆板的限制。因此，范围的描述应被认为特定地公开了所有可能的子范围以及在那些范围内的个体数值。例如，范围诸如由1到6的描述应理解为具有特定公开的子范围诸如1到3，由1到4，由1到5，由2到4，由2到6，由3到6等等，以及那些范围内的个体数字，例如，1，2，3，4，5，以及6。这些应用与范围的宽度无关。本专利技术的应用可使用，除非另有陈述，传统方法以及有机化学，聚合物技术，分子生物学(包括重组技术)，细胞生物学，生物化学，以及免疫学的描述，其在本领域技术人员的知识范围之内。这些传统方法包括聚合物阵列合成，杂交，连接，以及利用标记进行杂交的检测。合适技术的特定例证可在下文中实施例中参考。然而，其它相同的常规方法当然也可以被使用。这些传统的方法和描述可在标准的实验手册中发现，诸如Genome AnalysisA Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using AntibodiesA Laboratory Manual，CellsA LaboratoryManual，PCR PrimerA Laboratory Manual，and Molecular CloningALaboratory Manual(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，Biochemistry，(WH Freeman)，Gait，″Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach″1984，IRL Press，London，所有的整体引入作为用于所有的目的的参考。本专利技术在某些优选的实施方案中可利用固体基质包括阵列。适用于聚合物(包括蛋白质)阵列合成的方法和技术已描述在U.S.S.N09/536,841，WO00/58516，U.S.专利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555，和6,136,269，PCT申请PCT/US99/00730(国际公开号WO 99/36760)和PCT/US01/104285，以及美国系列申请Nos.09/501,099和091122,216中，其全部整体引入作为参考用于所有的目的。优选的阵列购自Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)。参见www.affymetrix.com。在特异性实施方案中描述合成技术的专利包括美国专利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸阵列描述在许多上述的专利中，但相同的技术被用于多肽阵列。本专利技术也涉及许多将聚合物连接于固体基质的应用。这些应用包括基因表达监控本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测目的ＲＮＡ的存在的方法，所述方法包括下列步骤：提供包括其可能具有或可能不具有所述目的ＲＮＡ的ＲＮＡ的样品；将所述ＲＮＡ连接于具有下式的标记试剂：＊＊＊其中Ｂ是杂环部分；Ｘ是允许核酸标记化合物连接于所述 片段的３′ＯＨ基团的官能团；Ｙ选自－Ｈ，－ＯＨ，－ＯＲ，－ＳＲ，－ＮＨＲ，或卤素；Ｌ是接头基团；并且Ｓｉｇ是提供标记的ＲＮＡｓ的可检测部分；提供具有针对所述目的ＲＮＡ的探针的核酸阵列；将标记的ＲＮＡｓ杂交于所述核酸阵列；以及 测定所述探针的杂交程度来确定所述目的ＲＮＡ的存在。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：凯尔B科莱，格伦H麦高尔，维维张，安东尼D巴龙，
申请(专利权)人：阿菲梅特里克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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