爪哇根结线虫分子检测引物及其用法制造技术

本发明专利技术爪哇根结线虫分子检测引物及其用法，专用于南方、爪哇和花生根结线虫快速分子检测和鉴定，属于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。设计了三对ＰＣＲ引物，即ＭＩ－Ｆ／Ｒ、ＭＪ－Ｆ／Ｒ和ＭＩ－Ｆ／ＭＴ－Ｒ，其分别在南方根结线虫、爪哇根结线虫以及南方、爪哇和花生根结线虫群体上特异性地扩增出９５５ｂｐ、５１７ｂｐ和７９９ｂｐ的产物。三对引物的扩增灵敏度达到了１／３条二龄幼虫、雄虫或雌虫。这表明这些引物可被用于生产实践中土样和根样中三种主要根结线虫的快速可靠的检测和鉴定。附图为引物ＭＩ－Ｆ／Ｒ、ＭＪ－Ｆ／Ｒ和ＭＩ－Ｆ／ＭＴ－Ｒ分别对南方、爪哇和花生根结线虫１／３条二龄幼虫裂解液的ＰＣＲ扩增产物电泳图。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请为申请日2003年7月28日，申请号03131763.4，名称一种根结线虫快速分子检测引物及其用法的分案申请。
本专利技术爪哇根结线虫分子检测引物及其用法，专用于南方、爪哇和花生根结线虫快速分子检测和鉴定，属于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。二、技术背景根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生物，是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物和世界各国的植物检疫对象。迄今已记载的根结线虫有约70种，其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)因其广分布性和多寄主性是最重要的种类(Jepson S B.Identification ofroot-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Sasser J N，Carter CC.Overview of the international Melodogyne project 1975-1984.InSasser J N，Carter CC，eds.An Advance Treatise on Meloidogyne.vol.1.Biology and Control.NorthCarolina State University GraphicsRaleigh，1985，19-24.)。在中国，这三种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15-25％，有时达70％以上(徐建华等.江苏省大棚蔬菜寄生线虫的种类和发生.南京农业大学学报，1994，1747-51.)，严重地制约了大棚蔬菜、果树、花卉等作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数亿元以上。控制根结线虫病发生的主要途径有使用化学杀线虫剂、选种抗病作物品种、实施轮作、建立无病种苗生产基地和对进出口农作物进行严格的检疫。化学杀线虫剂虽防效显著，但因潜在的环境污染问题其使用范围已受到严格的限制；作物抗性的利用在蔬菜作物根结线虫病的治理上已得到广泛和有效的应用(Roberts P A.Current status of the availability，development and use of host plant resistance tonematodes.J.Nematol.，1992，24213-227.)；无病种苗生产基地的建设对于无病区农作物，尤其是果树等多年生木本作物根结线虫病的防治至关重要；至于植物检疫，不仅可及时堵截国外根结线虫群体的传入，而且也是确保国内经济作物安全出口的必要手段。由于主要根结线虫种类间存在显著的致病性差异，上述非化学性防治方法的成功应用依赖于对目标区域和对象上发生的根结线虫种类进行快速而准确的检测和诊断。根结线虫的种类鉴定传统上依据虫体的形态特征或同工酶谱(Jepson S B.Identification of root-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Esbenshade P R，Triantaphyllou A C.Isozyme phenotypes for the identification ofMeloidogyne species.J.Nematol.，1990，2210-15.)。但两种鉴定法均需要适宜雌虫的存在，因而不适用于生产上多数情况下出现的土壤样本中幼虫的检测和诊断，而且形态鉴定法因雌虫形态的种间近似性和种内变异性也常常不可靠。为了克服形态和同工酶鉴定法的局限性，国际上自90年代兴起了根结线虫种类分子鉴定的研究。针对南方、爪哇、花生根结线虫等主要种类，最初的研究集中于基于分子杂交的线虫基因组限制性片段长度多态性(RFLP)分析(Piotte C et al.Molecular characterization of species and populations of Meloidogyne from variousgeographic origins with repeated-DNA homologous probes.Funda.Appl.Nematol.，1992，15271-276.)，但RFLP鉴定法不仅程序冗长繁琐，而且需要相对多量的高质量线虫DNA，显然不适用于田间线虫样本的日常诊断和检测。之后的研究均采用基于PCR的DNA分析法，包括对线虫基因组进行随机扩增的随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹法(Castagnone-Sereno P et al.Genetic polymorphism between and withinMeloidogyne species detected with RAPD markers.Genome，1994，37904-909.；Cenis JL.Identification of four major Meloidogyne spp.by random amplified polymorphic DNA(RAPD-PCR).Phytopathology，1993，8376-80.)，对线虫基因组线粒体DNA(mtDNA)进行特异扩增的PCR-RFLP分析法(Powers T O，Harris T S.A polymerase chainreaction method for identification of five major Meloidogyne species.J.Nematol.，1993，251-6.；Stanton J et al.Nucleotide polymorphisms and an improved PCR-based mtDNAdiagnostic for parthenogenetic root-knot nematodes(Meloidogyne spp.).Funda.Appl.Nematol.，1997，20261-268.)，和通过将RAPD标记转化为序列确定扩增区域(SCAR)标记的SCAR标记鉴定法(Zijlstra C et al.Identification of Meloidogyneincognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterized amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology，2000，2847-853.)。但目前这些已研制的南方、爪哇和花生根结线虫的分子鉴定法都存在着一定的缺陷。RAPD指纹法因使用短PCR引物而试验结果不稳定可靠；mtDNA-PCR-RFLP分析法虽结果可靠且灵敏度较高，但该方法需对PCR扩增产物用多种限制性内切酶进行酶切而使得诊断时间过长和费用昂贵；而已有的SCAR标记鉴定法则检测灵敏度只达1-10ng纯化的DNA，不能对生产上常见的土壤样本中的幼虫直接进行鉴定。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是克服已有根结线虫分子鉴定法存在的缺陷，提供结果可本文档来自技高网...

【技术保护点】
爪哇根结线虫分子检测引物，包括爪哇根结线虫高效特异扩增ＰＣＲ引物对ＭＪ－Ｆ和ＭＪ－Ｒ，其引物序列为：ＭＪ－Ｆ５’－ＡＣＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＣＴＧＧ－３’；ＭＪ－Ｒ５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣ －３’；上述ＭＪ－Ｆ和ＭＪ－Ｒ引物对在爪哇根结线虫群体上特异性地扩增出５１７ｂｐ的产物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建华，孟庆鹏，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]