长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法技术

本发明专利技术公开了一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法。方法的步骤是：目的基因进行聚合酶链式反应扩增并检测；阳性产物约５μｇ１００℃煮沸变性，冰上冷却；将检测用基因芯片用磷酸缓冲液润湿后，加入预杂交液进行预杂交；接着加入制备好的５μｇ变性ＤＮＡ，６０℃进行杂交；用洗膜液Ⅰ洗涤２次，用洗膜液Ⅱ洗涤；将芯片放入混有１×ＳＹＢＲ　　Ｇｒｅｅｎ　　Ｉ的１×ＴＥ缓冲液染色；用ＴＥ缓冲液漂洗，重复２次；紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更灵敏、稳定、可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
自1992年Adams提出表达序列标签(expressed sequence tag)和随后的大规模表达序列标签技术的建立，以及生物技术的发展和生命科学发展的需要，基因芯片技术应运而生。基因芯片(Biochips)的实质就是在面积不大的基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置地可寻址的生物识别分子(R.J.Lipshutz et al.，Bio Techniques 19(1995)，442-447；S.P.Fodor et al.，Nature364(1993)，555-556；S.P.Fodor et al.，Science 251(1991)，767-773；A.C.Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的基因芯片主要是用于DNA序列测定，基因表达谱鉴定(D.J.Lockhart et al.，Nature Biotechnol.14(1996)，1675-1680)和基因突变体的检测和分析(Feriotto G，et al.，Hum Mutat1999；13390-400；Hacia J.G.et al.，Nat Genet 1999；21(suppl 1)42-7；Hacia JG，etal.，Nat Genet 1999；22164-7；Nilsson P，et al.，Biotechniques 1999；26308-16)，所以又称为DNA芯片或基因芯片。目前，这一技术以扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域。如今基因芯片主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、动电微阵列和蛋白质芯片等。运用基因芯片技术，将获得的芯片运用杂交技术和扫描技术对基因芯片进行芯片处理、有效数据提取、分析和报告，可获得相应的基因表达谱(Gene expression profiling)。基因芯片因具有强有力性、灵活性、敏感性和相对简单等特点而被应用在许多领域，如DNA序列测定、基因多态性检测、新基因的发现、疫苗和药物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS2000；9711655-11660)。基因芯片技术的发展势必带动一大批相应技术的发展，如基因芯片的信号检测方法。目前基因芯片信号检测方法主要包括以Cy5/Cy3标记的荧光信号检测方法和以同位素标记的信号检测方法，而且这些方法目前大都应用于高通量的基因芯片的信号检测中，但无论应用那种信号检测方法，都需要对探针进行标记，而且应用Cy5/Cy3荧光标记需要对Cy5和Cy3分别进行两次，用同位素标记不仅能够对操作者的人身受到伤害，还会对环境造成核辐射污染。鉴于此，本专利技术提供了一种。方法的步骤是运用特异引物对目的基因进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并用琼脂糖凝胶进行电泳检测；聚合酶链式反应扩增阳性产物约5μg 100℃煮沸5min变性后，直接放入冰上冷却3-5min，以备探针杂交用；将检测用基因芯片用0.25M的磷酸缓冲液(pH7.2)进行润湿后，加入预杂交液(0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃进行预杂交1-2小时；接着加入制备好的5μg变性探针DNA(该探针无需进行任何标记，如同位素、生物素等)，60℃进行杂交10-12小时；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0)，0.1％SDS)洗涤2次，每次20min，用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗涤15min；将芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2次；在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更灵敏、稳定、可靠。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种。方法的步骤为1)运用特异引物对待测目的基因进行聚合酶链式反应扩增并用琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性PCR产物备用；2)聚合酶链式反应扩增产物5μg 90-100℃煮沸5-10min进行变性后，直接放入冰上冷却3-5min；3)将检测用基因芯片用0.25M的磷酸缓冲液，pH7.2，进行润湿后，加入预杂交液，55-65℃进行预杂交1-2小时；预杂交液为0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量体积比为7％十二烷基磺酸钠，重量体积比为1％牛血清白蛋白；4)接着加入步骤2)的5μg变性DNA，55-65℃进行杂交10-12小时；5)用洗膜液I洗涤1-3次，每次15-20min；洗膜液I为2×SSC，重量体积比为0.1％十二烷基磺酸钠；2×SSC为0.3mol/L氯化钠，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0； 6)用洗膜液II洗涤15-20min；洗膜液II为0.1×SSC，重量体积比为0.1％十二烷基磺酸钠；7)将基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液中染色5-10min；1×TE缓冲液为10mmo/LTris碱，pH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；8)用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2-3次；9)在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。本专利技术的优点是1)该方法省却了对探针进行标记的繁杂程序，特别是避免了同位素标记对人体所造成的伤害和对环境造成的放射污染；2)应用该方法可以克服单纯运用聚合酶链式反应扩增可能造成的假阳性结果，使所得结果更可靠。3)该方法与常规的检测方法相比具有高灵敏度和较高的检出率。附图说明图1是Nos终止子基因为探针杂交后进行染色的结果，图中1为Nos终止子，2为NPTII基因，3为CP4-EPSPS基因，4为Bar基因；图2是用于基因芯片的结构示意图；图3是用于基因芯片图2的方阵结构放大示意图。具体实施例方式实施例(一)长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的制备如图2所示，基因芯片是在平面型支撑载体5的平面上被覆有带正电荷材料的膜6，在该膜层的表面设有点阵7，在点阵7上排布有如下供转基因植物判断用的外源基因探针1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。点阵7为排布的凹窝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长度大于五十个碱基的寡核苷酸的基因芯片的信号检测方法，其特征在于，方法的步骤为：１）运用特异引物对待测目的基因进行聚合酶链式反应扩增并用琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性ＰＣＲ产物备用；２）聚合酶链式反应扩增产物５μｇ９０ －１００℃煮沸５－１０ｍｉｎ进行变性后，直接放入冰上冷却３－５ｍｉｎ；３）将检测用基因芯片用０．２５Ｍ的磷酸缓冲液，ｐＨ７．２，进行润湿后，加入预杂交液，５５－６５℃进行预杂交１－２小时；预杂交液为０．２５ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液，ｐＨ ７．２，１ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸，ｐＨ８．０，重量体积比为７％十二烷基磺酸钠，重量体积比为１％牛血清白蛋白；４）接着加入步骤２）的５μｇ变性ＤＮＡ，５５－６５℃进行杂交１０－１２小时；５）用洗膜液Ⅰ洗涤１－３次，每次１５－ ２０ｍｉｎ；洗膜液Ⅰ为２×ＳＳＣ，重量体积比为０．１％十二烷基磺酸钠；２×ＳＳＣ为０．３ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，０．０３ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠，ｐＨ７．０；６）用洗膜液Ⅱ洗涤１５－２０ｍｉｎ；洗膜液Ⅱ为０．１×ＳＳＣ，重量体积比为０．１％十二 烷基磺酸钠；７）将基因芯片放入混有１×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ的１×ＴＥ缓冲液中染色５－１０ｍｉｎ；１×ＴＥ缓冲液为１０ｍｍｏ／ＬＴｒｉｓ碱，ｐＨ８．０；１ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸，ｐＨ８．０；８）用ＴＥ缓冲液漂洗５ －１０ｍｉｎ，重复２－３次；９）在２５４ｎｍ紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李德葆，骆红梅，戴承恩，姜玉新，董海涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]