用于癌症检测的血浆或血清标记及方法技术

一方面，本文提供了用于检测患者的非临床诊断的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从患者抽取血清或血浆，然后检测血清或血浆中的β－连环蛋白ＲＮＡ。另外，在该实施方案中，所述方法包括基于检测出的β－连环蛋白ＲＮＡ确定癌症的存在。另一方面，本文提供了用于检测患者的非临床诊断的癌症的方法的另一个实施方案。在该实施方案中，所述方法包括从患者抽取血清或血浆，然后检测血清或血浆中的β－连环蛋白ＤＮＡ。另外，在该实施方案中，所述方法包括基于检测出的β－连环蛋白ＤＮＡ确定癌症的存在。还公开了用于检测患者的非临床诊断的癌症的相关方法，包括检测血清或血浆中β－连环蛋白相关基因ＲＮＡ以及β－连环蛋白相关基因ＤＮＡ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基于PCR的方法，检测血浆或血清标记，用于癌症的诊断、早期检测、监测和群筛，更具体地，是对于结肠直肠癌的血浆或血清中β-连环蛋白(catenin)RNA和DNA的检测。
技术介绍
结肠直肠癌(CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。CRC新病例的数目自1975年以来一直在增加。大于70％的CRC病例是由散发性腺瘤或腺瘤状息肉发展而来。早期检测和手术切除息肉据信是防止良性息肉发展为恶性肿瘤从而降低CRC所致的死亡率的最有效的方法。结肠直肠癌传统的筛选方法包括乙状结肠镜检、粪隐血试验、结肠镜检及双对照钡剂灌肠。然而，这些传统方法饱受限制，并且是侵入性的、花费高、预测值低或者造成低检出率。例如，WO0142504(特此将其教导并入作为参考)公开了用于检测血浆或血清中与胞外肿瘤相关的核酸的多步反应方法。需要进一步的改进。β-连环蛋白最初是通过其与钙粘着蛋白的相互作用鉴定的。最近证据表明其作为转录因子发挥作用，并在Wnt-信号传导路径中起着关键作用(Willert&Nusse，1998)。已经证明胞浆和核β-连环蛋白信号传导的累积与广泛种类肿瘤的生成密切相关(Morin，1999)。已经发现利用免疫组织化学染色核β-连环蛋白的水平与结肠直肠肿瘤发生中假设的后续阶段高度相关，其中阳染在正常组织中为0％、息肉为8％、腺瘤为92％，而癌瘤为100％。还已发现核β-连环蛋白信号似乎清楚地将息肉(非腺瘤状息肉)与腺瘤(腺瘤状息肉)区分开来。这将是CRC临床诊断或早期检测的有用标记，其中腺瘤被当作危险因素的终点。不过，基于核β-连环蛋白评价的这种诊断方法需要结肠镜检操作，随后手术切除可疑组织。因此，急需用于癌症早期检测的有效、更少侵入性、更为准确的测试。本专利技术满足了这种需要。专利技术概述本专利技术提供了基于PCR(聚合酶链式反应)的方法或操作，检测与β-连环蛋白相关的血清或血浆标记RNA和DNA，以提供有效、更少侵入性且更为准确的测试，用于结肠直肠及其它癌症类型的诊断、早期检测、监测和群筛。应当理解，这种检测血清中β-连环蛋白RNA和DNA的方法可应用于编码β-连环蛋白相关蛋白的其它血浆和血清RNA和DNA。在一个实施方案中，所述RNA或DNA来自基因编码的β-连环蛋白、α-连环蛋白、E-catherin及其它β连环蛋白相关蛋白。本专利技术的方法包括检测来自人类或动物的血清或血浆RNA或/和DNA作为诊断、早期检测、监测、治疗和群筛处于不同进程和临床阶段的肿瘤疾病的工具。本专利技术的一个优势在于该方法非侵入性的性质，而第二优势在于提高的样品收集的方便性和灵敏度。本专利技术多个实施方案的细节列于下文。这些实施方案仅用于举例说明的目的，而且本专利技术的原理可以其它实施方案来实施。本专利技术的其它特点和优势将由以下的说明和实施例而变得清楚。 附图说明为更全面地理解专利技术，现在就参考以下结合附图所进行的详细说明。在此强调为清楚讨论起见，某些要素可能不予举例说明。现在就参考以下结合附图所进行的详细说明，其中图1a、图1b和图1c图解说明了利用RT-PCR对来自结肠直肠癌瘤患者血浆的β-连环蛋白RNA的检测。图2a和图2b图解说明了利用RT-PCR对来自患者的血液β-连环蛋白RNA进行结肠直肠腺瘤的检测。图2c图解说明了利用RT-PCR对来自患者的血液β-肌动蛋白RNA进行结肠直肠腺瘤的检测。图3a、图3b、图3c、图3d和图3e图解说明了对来自腺瘤或癌瘤患者以及正常对照的血清β-连环蛋白DNA的检测。专利技术详述本专利技术披露了对用于结肠直肠癌早期检测的灵敏且特异性的生物标记的研究。对解释结肠直肠癌肿瘤发生的分子机制的超前理解有助于鉴定为数不多的致癌基因和肿瘤抑制剂作为潜在的结肠直肠癌形成和早期检测的临床生物标记。这些包括k-ras、APC、p53、MCC、DCC基因。然而，没有一个候选标记能够单独提供满意的检出率。最近对癌症患者血样中k-ras、APC和p53突变的基于PCR的检测的确极大地提高了样品收集的方便性。不过，检出率通常低于由原发性肿瘤所观察到的检出率。例如，在对14个结肠直肠癌患者的研究中，其中有7个证实了k-ras突变，同一突变见于6个患者的血清。血清阳性率为86％(Anker 1997)。另一个研究表明杂合性丢失(LOH)、微卫星不稳定、k-ras及p53突变的血清阳性率分别为0、0、19和70％(Hibi 1998)。已在其它类型的癌症中获得相似结果，其中见于血清DNA(脱氧核糖核酸)的遗传变化倾向于比见于原发性肿瘤的遗传变化更低(Kopreski 2001；Sozzi 1999；von Knobloch 2001)。与其它相关研究相比，本专利技术利用血清β-连环蛋白DNA早期检测结肠直肠癌可满足作为早期检测标记的标准1.该标记差异性地存在于正常及癌变前或肿瘤携带患者的血液中；2.该方法具有检测直径小至4mm的腺瘤状息肉的能力；3.该方法简便，具有高准确度；4.所需血样量小(2-5ml)，并且样品收集是通过非侵入性的正常抽血操作。从而，本专利技术提示血清或血浆中β-连环蛋白DNA水平，连同β-连环蛋白RNA水平，可为利用早已存在的仪器和试剂对结肠直肠癌进行有效准确测试的探索提供一种解决方法，因此适于对这种日益增长的常见癌症的大范围群筛、早期检测以及疾病监测。实施例以下实施例旨在举例说明，而并非限制本文所述专利技术的实施方案。具体地，在如下的讨论中，列举了众多具体的细节，以为本专利技术公开提供透彻的理解。不过，本领域技术人员将会理解文中的有些技术无需此类具体细节就可能实施。在其它情况下，公知的要素或具体细节已被精简或完全省略，这是因为对这些特征的详细讨论被认为对于获得对本专利技术公开的完整理解不是必要的，并且被认为是在相关
普通技术人员的理解范围之内的。实施例1*在结肠直肠癌瘤患者的所有血浆样品中检测到β-连环蛋白RNA为检测血浆β-连环蛋白的存在，利用将产生224bp基因外显子3区的引物#1对来自癌瘤患者的两份血样进行RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)。由表达高水平β-连环蛋白的癌瘤提取的RNA样品作为阳性对照包括在内。结果表明当反应中存在反转录酶(RT)时，两份血浆和阳性对照RNA样品中都产生224bp条带，但不存在反转录酶则没有条带(图1a)。利用内含子跨接引物(引物#2，表2)对其它10份血浆RNA样品进行了RT-PCR分析。数据显示在所有10份患者血浆样品中清楚地检测到250bp的片断(图1a，泳道1-10)，提示β-连环蛋白RNA于癌瘤患者循环血中的存在。数据也证明所述反应是RT-依赖性的(图1b，泳道12)。基因组DNA样品作为PCR反应的阳性对照包括在内，并且如期出现450bp的条带(图1b，泳道11)。为证明所述250bp条带来自血浆中的RNA而非DNA模板，对未经DNase I事先处理的三份剩余血浆RNA样品进行测试。凝胶上出现了两种PCR产物由RNA扩增的250bp条带，以及由DNA污染的血浆RNA提取物扩增的450bp条带。所有三份样品在存在RT时均产生250和450bp的条带(图1b，泳道13-15)，而RNase处理的DNA样品在不存在RT时观察到单一的450bp条带(图1b，泳道1)。利用上本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测患者的非临床诊断的癌症的方法，所述方法包括：从患者抽取血清或血浆；检测血清或血浆中的β－连环蛋白ＲＮＡ；和基于检测出的β－连环蛋白ＲＮＡ确定癌症的存在。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：萧文鸾，黄思铨，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]