本发明专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-451和miR-409-3p的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于胰腺癌的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。
技术介绍
胰腺癌是常见的消化道肿瘤之一，据估计，全球2008年新发胰腺癌病例达27万。在我国，近20年来胰腺癌发病率增长了将近6倍，特别是在经济较发达的地区，胰腺癌的发病率已与西方国家持平。胰腺癌恶性程度高，预后极差，由于其特殊的生物学行为，即易于侵犯血管和神经，肿瘤很小时就发生远处转移，对常规化疗、放疗和免疫治疗等均不敏感等，我国的5年生存率仅为5%左右。近年来，随着胰腺癌发病率和死亡率的继续增高，胰腺癌已严重威胁着人类的健康和生命。 尽管胰腺癌高度恶性，但是如果能早期发现早期治疗，仍可获得最佳治疗效果，如早期胰腺癌手术切除率为90%-100%，5年生存率可达70%-100%，与进展期胰腺癌相比，两者治疗效果存在着巨大的反差。可是，由于胰腺解剖位置深在及胰腺癌的生物学特性，导致了胰腺癌早期诊断困难，大部分患者就诊时已处于晚期。目前对胰腺癌的生物学标志进行了大量而广泛的研究，包括基因标记、血清学标记和细胞学标记等，由于这些指标的特异性和敏感性各有差异，对于早期胰腺癌目前还没有准确有效的筛查方法，也缺乏可靠的诊断措施，鉴于此，胰腺癌早期诊断率亟待提高，寻找有效的标志物对胰腺癌早期诊断、促进其预后具有重要意义。MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点,它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性，通过与靶mRNA的3'端非编码区结合，降解或者抑制mRNA的翻译导致靶基因的转录后沉默，从而调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNA已经逐步摆脱了 DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。近年来，miRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNA通过负调控基因的表达与肺癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌等的发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。血清/血浆miRNA作为肿瘤诊断和预后分子标志物不仅具有创伤小，方法准确、便捷的优势，而且还可改进疾病诊断、肿瘤分类、预后估计、疗效及复发预测的精度。但是，由于血清/血浆中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清/血浆miRNA在肿瘤临床检测中亟待解决的问题。另一方面，仅仅采用一种血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物往往特异性不足，若将多种miRNA组合使用并与其他类型肿瘤标志物检测相结合，可有望显著提高诊断的准确性。然而，目前还没有用于胰腺癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出胰腺癌异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国胰腺癌的诊断现状必将是一次有力的推动。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物。本专利技术的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。 本专利技术的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术第四个目的是提供胰腺癌辅助诊断的试剂盒。专利技术人通过分离和研究胰腺癌患者及与其年龄、性别匹配的健康对照血清/血浆中miRNAs，寻找一组与胰腺癌高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的胰腺癌诊断试剂盒，为胰腺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-451和miR-409-3p 的组合。所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为miR-451 的引物为 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物为 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述的血清/血浆miRNA标志物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种胰腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-451和miR-409_3po所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血衆miRNA中miR-451和miR-409_3p的引物。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNA标志物的引物为miR-451 的引物为 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物为 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本专利技术解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析选择胰腺癌病例、与胰腺癌病例年龄、性别匹配的健康人对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析胰腺癌病例和健康人对照间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进一步单个样本验证，确定胰腺癌发病相关血清/血浆miRNAs (3)血清/血浆miRNA筛查和诊断试剂盒的研制根据胰腺癌病例和健康人对照的特异血清/血衆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制患者年龄和性别等因素对于发病的影响)，并米用了 RT-PCR、Real-time PCR 方法、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分I.研究样本的选择( I)经病理学明确诊断的胰腺癌病例(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗 (3)与病例年龄、性别匹配的健康人对照本研究共采用48例符合标准的样本进行研究。2. Trizol 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到 5 μ gRNA/50ml血清或血浆。3. TLDA (Applied Biosystems 公司)芯片检测(I)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品(2) cDNA样品进行预扩增反应(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR？451和miR？409？3p的组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘峰，高勇，祁付珍，胡志斌，董静，闻洋，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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