一种测定人血浆和／或血清中重组双功能水蛭素的方法技术

本发明专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆／血清中重组双功能水蛭素的分析方法。本方法采用超滤法分离蛋白，解决了水溶性的水蛭素和蛋白的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器，明显提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间为１５ｍｉｎ以内。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的选择性提高，灵敏度提高两个数量级，适合于重组双功能水蛭素体内药物的浓度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人 血浆/血清中重组双功能水蛭素的方法。
技术介绍
水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝 血酶结合，以防止血栓形成。由于其抗栓抗凝作用优于传统抗凝药肝素，因此具有广 阔的应用前景。目前已通过基因工程技术获得重组水蛭素。重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin )是一种新型高效的抗凝血药物，目前处于临床 I期研究阶段，为了开展该药物的体内药动学研究，体内药物的浓度测定是关键的技术 之一。目前国内外有关测定水蛭素的方法主要采用凝血酶时间测定法(TT法)、APTT测定 法、生物底色法、蝰蛇毒凝血时间测定法(ECT法)、放射免疫法、酶联免疫法(EMIT) 以及荧光标记测定法等。上述这些方法存在种种缺陷如操作繁琐费时，效率低，选 择性差，灵敏度低等。由于水蛭素是水溶性物质，将其从血浆中分离存在很大的困难， 迄今未见有效的方法将其分离并浓縮，也使血浆中低浓度的有关水蛭素药物的定量分 析无法实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确、灵敏测定人血浆中水蛭素浓度的方法，具体涉及 。本方法对血浆或血清样品进行定量分取，用超滤法分离出超滤液，超滤液经冷冻 干燥，复溶解后进色谱柱分离，经色谱柱分离后，用质谱检测器检测，进行血浆/血清 中水蛭素浓度的测定。本方法具有准确、灵敏，选择性好，血浆用量少等优点，适合该水蛭素药物的体 内浓度测定和体内过程的研究。本专利技术方法通过下述方法和步骤进行对待测样品经过预处理后，利用超滤技术将蛋白从药物中分离出来，采用乙 腈0.1甲酸为流动相，梯度洗脱，质谱检测；包括以下步骤 (1)蛋白分离水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离以20%甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀 后置于超滤管(Millipore， 50K)于4000g， 25。C条件下超滤20min;(2) 样品富集水蛭素的浓縮超滤液置于1.5ral Eppendorf管中，-7(TC条件下冷冻干燥，完全 冻干后取出；-70'C条件下保存；(3) 样品分析将冻干后的样品取出，加入10%甲酸50^1复溶解，10pl进样做LC/MS分析；色谱条件采用填料为十八垸基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统 采用通用型高压泵，流动相采用甲醇和0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；质谱条件单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下选择离 子监测(M/Z 1433)，干燥气流速13L/min，雾化气压力50psig，干燥气温度350°C， 碎片电压220V,毛细管电压5500V，内标法定量。所述的待测样品为人血浆和/或血清；所述的色谱条件其中色谱柱采用Agilent Extend Cw分析柱(150X2. lmm， i. d. ， 5 ym);柱温为35 'C;流动相是甲醇一0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，流速为O. 3 ml/min; 质谱条件采用电喷雾离子化，采集正离子。本方法可用于血桨/血清中水蛭素定量测定。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的 选择性和灵敏度均得到明显的提高，使重组双功能水蛭素的灵敏度提高两个数量级， 可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定，适合于重组双功能水蛭素体内药物的浓 度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。本专利技术方法具有如下优点采用超滤法分离蛋白，解决了水溶性的水蛭素和蛋白 的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器， 大大提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间为15min以内。重组双功 能水蛭素的最低检出量为25ng/ml血浆。线性范围为25 250 pg.1/1，线性相关系数良 好，方法回收率大于50%, RSD小于10 %。附图说明图l是典型色谱图，其中，上图为空白血桨；中图为空白血浆+标准品；下图为血浆供试品； 1为重组双功能水蛭素， 2为硫酸奎宁(I. S.)。具体实施方式 实施例1高效液相色谱质谱联用条件Agilent1100 LC/MSD系统:G1312A 二元泵、G1312A自动进样器、G1946D质谱检 测器、AgilentLC-MS色谱工作站；色谱柱Zorbax Extend C18 (150 mmX2.1 mm, 5 u m); 柱温:35 'C;流动相乙腈0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱(梯度程序设置为乙腈0%_90% 0-15min)，流速l.OmL* mirT1; ESI离子源(正离子检测，M/Z 1433)，干燥气流速 13L/min，雾化气压力30psig，干燥气温度350°C，碎片电压220V，毛细管电压 5500V。色谱行为空白血浆、加样血浆的色谱图见图1。从图中可见，内标和重组双功能水蛭素的 典型色谱保留时间分别为6 min和10 niin。血浆内源性杂质对样品的测定无干扰，两 者峰形良好，分离完全。整个色谱分析过程时间为15min以内。样品前处理取待测血浆样品适量，加入3倍于样品量的20%甲酸水溶液，混匀后置于超滤管 (Millipore， 50K)于4000g， 25。C条件下超滤20min。精密吸取超滤液300^1置于 1.5ml印管中，-70'C条件下冷冻干燥，完全冻干后取出，加入流动相100pl复溶解， 5^1进样做LC/MS分析。 线性试验分别精密吸取1000， 100, 10 mg.L—'重组双功能水蛭素标准工作液，用空白血浆稀 释定容至5mL,配制成含重组双功能水蛭素0.025， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5, 1， 2.5， 5ug.L—'的系列血样，各取血清150uL，按"血浆样品预处理"方法操作。以重组双 功能水蛭素与内标峰面积比(力)和重组双功能水蛭素的浓度(O作加权(l/0线性回 归，得标准曲线回归方程为/4=0.1307 C - 2.848X1(T3 r=0. 9999,线性范围为0. 025 5u g L—'。重组双功能水蛭素的最低检测限(L0D，信噪比〉3)为0. 025 u g L—1。 精密度和回收率试验精密吸取重组双功能水蛭素标准工作液，用空白血浆配制成含重组双功能水蛭素 0. 025， 0.1， 0. 5， 2. 5u g L一'的系列血样,各取血浆150u L，按"血浆样品预处理" 方法操作。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标 准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)X100 %即为回收率。表1是血浆中重组双功能水蛭素浓度的日内、日间精密度和方法回收率。表l<table>table see original document page 6</column></row><table>权利要求1、，其特征是采用超滤法和冷冻干燥法对待测样品进行预处理，在分析色谱柱分离后用质谱检测器检测，包括以下步骤(1)蛋白分离水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离以20％甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀后置于超滤管Millipore，50K于4000g，25℃条件下超滤20min；(2)样品富集水蛭素的浓缩超滤液置于1.5ml Eppendorf管中，-70℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定人血浆和／或血清中重组双功能水蛭素的方法，其特征是采用超滤法和冷冻干燥法对待测样品进行预处理，在分析色谱柱分离后用质谱检测器检测，包括以下步骤：（１）蛋白分离水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离：以２０％甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀后置于超滤管Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，５０Ｋ于４０００ｇ，２５℃条件下超滤２０ｍｉｎ；（２）样品富集水蛭素的浓缩：超滤液置于１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，－７０℃条件下冷冻干燥，完全冻干后取出，－７０℃条件下保存；（３）样品分析将冻干后的样品取出，加入１０％甲酸５０μｌ复溶解，１０μｌ进样做ＬＣ／ＭＳ分析，色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用甲醇和０．１％甲酸溶液，梯度洗脱；质谱条件：单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子源，正离子模式下选择离子监测Ｍ／Ｚ１４３３，干燥气流速：１３Ｌ／ｍｉｎ，雾化气压力：５０ｐｓｉｇ，干燥气温度：３５０℃，碎片电压：２２０Ｖ，毛细管电压：５５００Ｖ。内标法定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郁韵秋，苏圣民，莫炜，宋后燕，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]