涉及一种荧光定量ＰＣＲ试剂盒以及用于检测副溶血性弧菌的方法，该试剂盒由ＰＣＲ反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶管和去离子水管组成，该试剂盒用于副溶血性弧菌的适时、定量检测的步骤是，先采集和处理待测标本再进行加样、分子信标实时定量ＰＣＲ检测，根据阴性对照和阳性对照的ＣＴ值以及检测样本ＣＴ值来判断检测样本为阳性还是阴性，然后记录各样本的荧光值和ＣＴ值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。本发明专利技术具有闭管操作，避免假阳性，反应与杂交同步进行，检测时间短的显著效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物的测量的组合物，具体地说是涉及一种荧光定量PCR试剂盒以及用于检测副溶血性弧菌的方法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种嗜盐性细菌，属弧菌科(Vibrio)弧菌属，易引起食物中毒。副溶血弧菌产生的耐热直接溶血毒素(TDH)是重要致病因子，特异基因tdh是副溶血弧菌引起食物中毒的主要因子。目前，我国副溶血性弧菌常规检测方法有神奈川现象(Kanagawa phenomenon，KP)试验、生化鉴定、血清学反应、核酸杂交等技术，但这些试验或方法需经过增菌培养，存在操作繁琐、所需时间长(约4天)等不足。随着微生物基因组学的发展，近年来又出现了一种定量PCR技术，该技术是一种体外基因扩增技术。本领域内普通技术人员都知道，根据副溶血弧菌的特异基因tdh序列，设计引物，是可进行副溶血弧菌的PCR检测的。但是直接使用常规的PCR检测试剂盒来检测副溶血性弧菌，尚存在下列难以解决的技术问题1、常规的PCR检测试剂盒的反应管内不含有分子信标探针，必须“开盖操作”将PCR产物转移，进行琼脂糖电泳或Southern转移杂交等实验对PCR产物进行鉴定，容易污染，造成假阳性，而且耗费时间(4～5小时)，国家卫生部已限制其在临床上使用；2、常规的PCR检测试剂盒不含有标准品，不能对副溶血性弧菌进行定量检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是改良PCR检测试剂盒，以便用于检测副溶血性弧菌。本专利技术解决上述问题的技术解决方案是一种定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试管组成(1)PCR反应管管内反应液由以下体积份组分制成10×Buffer缓冲液4～6份、25mM MgCl2溶液2～4份、1.25mMdNTP溶液4～8份、序列为5’-TGGCTGACATCCTACATGAC-3’的50μM上游引物0.2～1.0份、序列为5’-TCTTCACCAACAAAGTTAGC-3’的50μM下游引物0.2～1.0份、序列为5’-FAM-CGAGCGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGGCTCG-DABCYL-3’的50μM环形分子信标探针0.2～1.0份、去离子水25～30份；(2)样本处理液管管内处理液由以下体积份组分制成0.5mol/LEDTA(PH8.0)8～12份、1％SDS200～300份、20mg/ml蛋白酶K5～8份和蒸馏水200～250份；(3)阳性对照管管内试剂为以下插入序列的重组阳性质粒DNAGGTCAATGTA GAGGTCTCTG ACTTTTGGAC AAACCGTAAT GTAAAAAGAA AACCGTACAAAGATGTTTAT GGTCAATCAG TATTCACAAC GTCAGGTACT AAATGGCTGA CATCCTACATGACTGTGAAC ATTAATGATA AAGACTATAC AATGGCAGCG GTGTCTGGCT ATAAGCACGGTCATTCTGCT GTGTTCGTAA AATCAGATCA AGTACAGCTT CAACATTCCT ATGATTCTGTAGCTAACTTT GTTGGTGAAG ATGAAGATTC TATTCCAAGT AAAATGTATT TGGATGAAACTCCAGAATAT TTTGTTAATG TAGAAGCATA TGAGAGTGGT AGTGG(4)阴性对照管管内试剂为重组阴性质粒DNA；(5)标准品管管内试剂分别为107、106、105copy/ml的重组阳性质粒DNA各一支；(6)聚合酶管管内试剂为5U/μl Taq DNA聚合酶管；(7)去离子水管管内试剂为去离子水； 上述定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法，依序由以下步骤组成(1)待测样本的采集和处理实验室内取包括副溶血性弧菌、沙门菌、大肠杆菌等15种细菌的肉汤培养物50μl，作为样本。或临床(现场)将相关海产品20克或者加入碱性蛋白胨过夜培养后匀浆，用PBS按1∶1重量比混匀，800rpm，离心1分钟，取上清1200rpm离心5分钟，弃上清，用200μl PBS液悬浮，作为样本。待处理液完全解冻后，取50μl加入0.5ml离心管内，再加入待测样本50μl，混匀，37℃放置10分钟，然后100℃煮沸10分钟，12 000rpm离心10秒，上清液作为扩增模板。此模板2～8℃可保存一周，-18℃可保存一个月。阴性对照和阳性对照无需处理，直接取5μl上机扩增。(2)加样先取DNA聚合酶0.5μl加入反应液管内(DNA聚合酶及反应液管用前需10 000rpm离心10秒)，然后取处理后的样本上清液、阴性对照、阳性对照和标准品(加前需混匀)各5μl分别加入反应液管内，混匀后10 000rpm离心10秒上机扩增。(3)PCR扩增和实时荧光检测扩增程序为94℃预变性3分钟，循环条件为94℃30秒、55℃40秒、72℃55秒，共40个循环，最后72℃延伸3分钟(同时设空白对照一管，空白对照只需在反应液管内加去离予水5μl混匀后10 000rpm离心10秒上机扩增)。(4)结果判断阴性对照的CT值应不出现数值；阳性对照的CT值应≤30；如不能满足上述条件则此实验为无效。检测样本CT值≤33时判断为阳性；检测样本CT值＞33或无数值时判断为阴性。(5)定量分析记录各样本的荧光值、CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。本专利技术所述的定量PCR检测试剂盒用于检测副溶血性弧菌的方法是在PCR反应体系中加入标记有报告基团(fluorophore)和淬灭基团(quencher)的茎环型荧光分子信标探针，在基因扩增过程中，PCR产物与探针杂交，根据能量共振转移现象(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，报告基团和猝灭基团分开，报告基团发出荧光而被检测，由于采用分子信标探针对PCR产物同时进行杂交检测，可以闭管检测，克服了常规PCR产物污染和假阳性的技术问题，茎环型荧光分子信标探针的使用使检测的特异性更好，同时还能对副溶血性弧菌进行实时定量检测，是病原微生物基因检测技术的发展方向。附图说明图1为副溶血性弧菌标准品分子信标实时定量PCR检测荧光强度和循环次数的对应关系2为副溶血性弧菌标准品拷贝数对数值和循环次数的标准曲线3为采用本试剂盒对15种细菌进行的分子信标实时定量PCR检测结果1、图2和图3均采用ABI Prism7000荧光定量PCR仪及其配套软件自动获得。从图1和图2所示结果可以看出不同浓度梯度的标准品的CT值理想，线形相关系数r为0.99以上；从图3所示结果可以看出2株副溶血性弧菌和标准品的CT值≤30，判断为阳性，余下细菌和阴性对照CT值＞33或无数值，判断为阴性。具体实施例方式例1所述的定量PCR检测试剂盒由以下7管组成(1)PCR反应管管内反应液由下列组分组成10×Buffer缓冲液5μl、25mM MgCl2溶液3μl、1.25mMdNTP溶液8μl、50μM上游引物0.5μl、50μM下游引物0.5μl、50μM环形分子信标探针0.5μl和去离子水2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试管组成： （１）ＰＣＲ反应管：管内反应液由以下体积份组分制成：１０×Ｂｕｆｆｅｒ缓冲液４～６份、２５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］溶液２～４份、１．２５ｍＭｄＮＴＰ溶液４～８份、序列为５’－ＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣ－３’的５０μＭ上游引物０．２～１．０份、序列为５’－ＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣ－３’的５０μＭ下游引物０．２～１．０份、序列为５’－ＦＡＭ－ＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＧ－ＤＡＢＣＹＬ－３’的５０μＭ环形分子信标探针０．２～１．０份、去离子水２５～３０份； （２）样本处理液管：管内处理液由以下体积份组分制成：０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）８～１２份、１％ＳＤＳ２００～３００份、２０ｍｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ５～８份和蒸馏水２００～２５０份； （３）阳性对照管：管内试剂为以下插入序列的重组阳性质粒ＤＮＡ： ＧＧＴＣＡＡＴＧＴＡ ＧＡＧＧＴＣＴＣＴＧ ＡＣＴＴＴＴＧＧＡＣ ＡＡＡＣＣＧＴＡＡＴ ＧＴＡＡＡＡＡＧＡＡ ＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡ ＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴ ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＧ ＴＡＴＴＣＡＣＡＡＣ ＧＴＣＡＧＧＴＡＣＴ ＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡ ＣＡＴＣＣＴＡＣＡＴ ＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣ ＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡ ＡＡＧＡＣＴＡＴＡＣ ＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧ ＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴ ＡＴＡＡＧＣＡＣＧＧ ＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴ ＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡ ＡＡＴＣＡＧＡＴＣＡ ＡＧＴＡＣＡＧＣＴＴ ＣＡＡＣＡＴＴＣＣＴ ＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴ ＡＧＣＴＡＡＣＴＴＴ ＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧ ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣ ＴＡＴＴＣＣＡＡＧＴ ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴ ＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣ ＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴ ＴＴＴＧＴＴＡＡＴＧ ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＡ ＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴ ＡＧＴＧＧ （４）阴性对照管：管内试剂为重组阴性质粒ＤＮＡ； （５）标准品管：管内试剂分别为１０↑［７］、１０↑［６］、１０↑［５］ｃｏｐｙ／ｍｌ的重组阳性质粒ＤＮＡ各一支； （６）聚合酶管：管内试剂为５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶管； （７）去离子水管：管内试剂为去离子水；。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万成松，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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