一种血清／血浆ｍｉＲＮＡ组合物及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种血清／血浆ｍｉＲＮＡ组合物及其应用。该ｍｉＲＮＡ组合物包括下列ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ及ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ中的任意两种或两种以上。本发明专利技术所筛选出的ｍｉＲＮＡ组合物及其引物对ＨＢＶ阳性者以及ＨＢＶ阳性的肝细胞癌患者检测的特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的蛋白标志物，大大提高了诊断的准确性。该ｍｉＲＮＡ组合物及其引物组合物均可在制备检测ＨＢＶ阳性和／或ＨＢＶ阳性肝细胞癌的试剂或工具中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种血清/血浆m i RNA组合物及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种血清/血浆miRNA组合物及其应用。技术背景肝细胞癌(Hepatocellμ Lar Carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，就全球而言，慢性HBV和HCV感染是原发性肝 细胞癌(HCC)主要的危险因素，尤其是慢性HBV感染与HCC发病呈现高度的地域一致 性，与全球75%的肝癌有关，在发展中国家甚至达到85%。HBV感染后的治疗是一个长期漫长的过程，在这个过程中，病情易出现反复活 动，病变常成阶段性进展，越晚越恶劣，越晚越难治，发生肝硬化后，抗病毒治疗也难 完全防止其进一步发展，而HCC更是恶性程度最高的肿瘤之一，病程短、进展快、预后 极差，5年生存率不到10%。因此，对HBV感染者的病情需要长期动态检测，掌握患者 的疾病状态和病情严重程度，对阶段性的进展更应及早诊断以确定针对性的防治方案， 最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进 展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生 活质量和延长存活时间。目前，血清HBV标志物和甲胎蛋白(AFP)是全世界应用最广泛的HBV感染和 HCC生物标志物(Biomarker)，转氨酶则是反映肝脏损伤程度的常用指标，但它们难以 反映HBV感染相关疾病的动态进展情况，对相应疾病的早期诊断效果也越来越不能满足 需要，如随着影像学的发展，AFP阴性的病例被确诊为肝癌，其诊断肝癌的敏感性仅为 40% -60%,特异性为70%-90%;针对肝硬化的诊断和病变程度判断则尚缺乏合适的生 物标志物。尽管目前国内外研究者正探索筛选新的生物标志物，以对AFP进行有效的补 充，但是难以突破传统生物标志物发展和应用中的瓶颈，即抗体难以制备和定量检测困 难。综上所述，HCC起病比较隐匿，并且预后不良，要加强HBV感染者病情的监 控，发现病情变化的早期指针，就需要针对HBV感染不同阶段，获得灵敏、特异、易于 检测的标志物。另外，HBV感染和HCC治疗效果有限，要进行治疗效果的早期判断， 发现更多有效的治疗靶标，进行靶向治疗就需要动态监测HBV感染和HCC治疗的效果， 了解HBV感染的自然史，HCC发生和发展的分子机制，获得易于调控的治疗靶标。因 此，寻找一类新型的特异性生物标志物是肝癌防治的当务之急。肝癌，特别是乙型肝炎相关性肝癌在我国的发病率高，死亡率高，严重危害人 们的健康，而乙型肝炎相关性肝癌目前尚无满意的治疗。国内外学者对肝癌开展了广泛 而深入的研究，但乙肝病毒与肝癌发生发展的关系尚未完全阐明。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的上述不足，提供在HBV阳性者和HBV阳性的HCC患者表达差异显著的血清miRNA组合物及其应用。本专利技术的另一目的在于提供这些miRNA的引物、这些引物的应用以及含有这些 引物的试剂盒，为实现肝细胞癌早期诊断提供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检 测手段。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种血清/血浆miRNA组合物，该miRNA组合物包括下列miRNA hsa-miR-122> hsa-miR~92a、hsa~let-7c> hsa-miR-23a、hsa-miR~23b、hsa-miR-223、 hsa-miR-342_3p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、 hsa-miR-125b及hsa-miR-lOa中的任意两种或两种以上。其中hsa-miR-122序列为 SEQ ID N0.27, hsa_miR-92a 序列为 SEQ ID N0.28, hsa_let_7c 序列为 SEQ IDN0.29, hsa-miR-23a 序列为 SEQ ID N0.30, hsa_miR-23b 序列为 SEQ ID N0.31, hsa-miR-223 序列为 SEQ ID N0.32, hsa-miR-342-3p 序列为 SEQ ID N0.33, hsa_miR-423-5p 序列为 SEQ ID N0.34, hsa-miR-375序列为 SEQ ID N0.35, hsa_miR-99a序列为 SEQ ID N0.36, hsa-miR-150 序列为 SEQ ID N0.37, hsa_miR-125b 序列为 SEQ ID N0.38, hsa-miR-lOa 序列为 SEQ ID N0.39。所述miRNA组合物优选包括hsa_miR-92a、hsa-miR-223,hsa_miR-423-5p、 hsa-miR-375> hsa-miR-99a 及 hsa-miR-lOa ；或者包括 hsa-miR-92a、hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、hsa-miR-342_3p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b 及 hsa-miR-lOa。所述miRNA为人成熟体miRNA。所述的miRNA组合物可在制备检测HBV阳性和/或HBV阳性肝细胞癌的试剂或工具中的应用。所述miRNA组合物的筛选方法包括以下步骤(1)收集慢性乙肝患者混合血清或血浆，提取总RNA;(2)采用Solexa测序技术，对上述总RNA中已知的人全部成熟 miRNA(miRBase 12.0，共692个)进行检测，与年龄、性别匹配的非HBV感染的正常对照组比对后初筛出慢性乙肝患者表达显著升高的miRNA ；(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，用实时荧光定量PCR方法(EvaGreen染料法)对正常人、HBV清除者、HBV携带者、慢性乙肝患者、慢性丙肝患者进行逐 个检测，从Solexa方法初筛出的miRNA中进一步筛选出稳定的表达差异显著的一组 miRNA ；(4)进一步用定量PCR方法对正常对照组(包括正常人、HBV清除者)、HBV 阳性者、慢性丙肝患者进行逐个验证，并对筛选出的miRNA在HBV阳性确诊过程中的应 用及临床价值进行评估；(5)进一步对HBV阳性者、HBV阳性的HCC患者进行逐个验证，并对筛选出 的miRNA在HBV阳性的肝细胞癌中的检测过程中的应用及临床价值评进行估。本专利技术使用的检测方法可以选自RT-PCR方法、Solexa测序技术 (Solexasequencing technology)、Real-time PCR 方法中的一种或几种。例如，血清中 miRNA分子的检测方法包括以下步骤(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA ；(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA ；(3)根据要检测的成熟体miRNA序列设计引物SEQ ID N0.1 SEQ IDN0.26进 行PCR反应；(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；(5) EB染色后在紫外灯下观察结果。在所述步骤( 之后还可以包括下列步骤用EvaGreen染料法检测并比较各组 血清中miRNA的量的变化。本专利技术还提供了 一种用于检测HBV阳性者、HBV阳性的肝细胞癌患者的 miRNA弓丨物组合物，包括本专利技术所述血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清／血浆ｍｉＲＮＡ组合物，其特征在于该ｍｉＲＮＡ组合物包括下列ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ及ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ中的任意两种或两种以上。

【技术特征摘要】
1.一种血清/血浆miRNA组合物，其特征在于该miRNA组合物包括下列miRNA hsa-miR-122、hsa-miR-92a、hsa~let-7c> hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、 hsa-miR-342_3p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、 hsa-miR-125b及hsa_miR-10a中的任意两种或两种以上。2.根据权利要求1所述的miRNA组合物，其特征在于所述miRNA组合物包 括hsa-miR-92a、hsa-miR-223、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a 及 hsa-miR-lOa。3.根据权利要求1所述的miRNA组合物，其特征在于所述miRNA组合物包括 hsa-miR-92a、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-342_3p、hsa-miR-423_5p、 hsa-miR-375、hsa-miR-125b 及 hsa-miR-lOa。4.一种miRNA引物组合物，其特征在于该引物组合物包括权利要求1所述miRNA的 引物对。5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于所述miRNA的引物组合物为 SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2 ； SEQ ID NO.3、SEQ ID N0.4 ； SEQ ID NO.5, SEQID N0.6 ； SEQIDNO.7、SEQ ID N0.8 ； SEQ ID NO.9、SEQ ID NO. 10； SEQIDNO.il> SEQ ID NO.12 ； SEQ ID NO.13, SEQ ID NO. 14 ； SEQ IDNO.15, SEQ ID NO. 16 ； SEQ ID NO.17、SEQ ID NO. 18 ； SEQ ID NO. 19、SEQ ID N0.20 ; SEQ ID NO.21、SEQ ID N0.22 ； SEQIDN0.23、SEQ ID N0.24 ；及 SEQIDN0.25、SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾科，李丽民，张辰宇，张峻峰，陈熹，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]