一种与乳腺癌相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与乳腺癌相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物及其应用。该标志物为ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２５、ｍｉＲ－２２２和ｍｉＲ－３２４－３ｐ的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于乳腺癌的辅助早期诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与乳腺癌相关的血清/血浆miRNA 标志物及其应用。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。据估计，全球2002年新发乳腺癌病例达115万， 占女性全部恶性肿瘤发病的23%，预计2010年将达到140-150万。在我国，乳腺癌的发病 率与西方国家相比较低，但近二十年来，其呈现显著增长趋势，平均年增长率达3-4%，远远 高于0.5%的世界平均增长水平。虽然乳腺癌的预后较好，但是由于其发病率较高，仍然是 女性因癌症死亡的首要原因。在我国北京，上海，天津等城市乳腺癌发病率已高居女性恶性 肿瘤发病的第一位、第二位。在2000年到2005年这5年间，我国女性乳腺癌患者增加了 38. 5%，每年因乳腺癌死亡的女性达1. 3万人。乳腺癌已成为威胁我国女性健康的首要恶 性肿瘤，是亟待解决的重大公共卫生问题。乳腺癌目前虽无特殊的预防措施，但是若能早期发现、早期诊断、早期治疗，预后 情况一般较好。所以，当前及将来相当一段时间内，争取早期诊断仍是乳腺癌防治的一项基 本策略。目前早期诊断乳腺癌的方式主要有乳腺自检，乳腺钼靶X线摄影、乳腺彩色多谱勒 超声检查、乳腺导管内视镜检查、乳腺导管灌洗、CT和磁共振等，若有无法辨别的肿块或脓 肿可进行细胞学穿刺检查。尽管近年来乳腺癌的诊断水平不断上升，但真正较为成熟或有 较好应用前景的乳腺癌诊断手段尚不多，有些早期乳腺癌患者由于肿块较小，或浸润较轻、 呈膨胀性生长、表现为光滑、活动、边界清楚，与良性肿瘤不易区别。此外，由于涉及社会文 化伦理等方面问题，一些年轻女性对于乳腺检查容易忽视或产生抗拒心理，不但不能保证 诊断对癌症患者诊断的准确性，对于处于早期阶段的乳腺癌患者，尤其是年轻患者的诊断 能力更为有限。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对乳腺癌做出明确的早 期诊断，这将有助于乳腺癌患者做出早期治疗，提高生存率。MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟 状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。它广泛存在 于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。MiRNA 的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从 参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度 入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因， 即所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNA 已经逐步摆脱了 DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新 的挑战。近年来，miRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNA通过负 调控基因的表达与肺癌，乳腺癌，胃癌，乳腺癌等的发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、 含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分 子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。然而，目前还没有用于乳腺癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出 乳腺癌异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国 乳腺癌的诊断现状必将是一次有力的推动。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与乳腺癌相关的血清/血浆 miRNA标志物。本专利技术的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。本专利技术的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备乳腺癌 辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术第四个目的是提供辅助乳腺癌诊断的试剂盒。专利技术人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康女性对照血清/血浆 中的miRNAs，寻找一组与乳腺癌高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于 临床应用的乳腺癌诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治 疗价值的新型小分子药物提供数据支持。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的一种与乳腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR_16、miR_25、 miR-222 和 miR-324_3p 的组合。所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为miR-16 的引物为 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物为 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物为 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述的血清/血浆miRNA标志物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-16、miR-25、 miR-222 和 miR-324_3p。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆miRNA中miR-16、miR-25和 miR-324-3p 的引物。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNA标志物的引物为miR-16 的引物为 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-222 的引物为 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物为 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14。所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本专利技术解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据 库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析选择乳腺癌病例、与乳腺癌病例年龄匹配的健康女性对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析乳腺癌病例和健康女性对照 间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进一步大样本多阶段验证。 (3)对已筛选的血清/血浆差异表达miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定乳腺癌发 病相关血清/血浆miRNAs (4)血清/血浆miRNA筛查和诊断试剂盒的研制根据乳腺癌病 例和健康女性对照的特异血清/血浆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期、患者年龄等因素 对于发病的影响)，并采用了 RT-PCR、Real-time PCR方法、Solexa测序技术、T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与乳腺癌相关的血清／血浆ｍｉＲＮＡ标志物，其特征在于该标志物为ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２５、ｍｉＲ－２２２和ｍｉＲ－３２４－３ｐ的组合。

【技术特征摘要】
一种与乳腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR 16、miR 25、miR 222和miR 324 3p的组合。2.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为 miR-16 的引物为 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 ；miR-25 的引物为 SEQ ID No. 1 禾口 SEQID No. 2 ；miR-222 的引物为 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18 ；miR-324_3p 的引物为 SEQ ID No.13 和 SEQ ID No. 14。3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物在制备乳腺癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈洪兵，胡志斌，张辰宇，马红霞，董静，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]