一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤：（１）准备ＤＮＡ；（２）利用ＰＣＲ方法采用三组特殊设计的四引物对ＤＮＡ进行扩增；（３）凝胶电泳；（４）观测结果。本发明专利技术应用特殊设计的引物，利用该基因检测方法，在完成ＰＣＲ反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断病人有无与吉非替林（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）［商品名：易瑞沙（Ｉｒｅｓｓａ）］疗效有关的ＥＧＲＦ基因点突变，及时指导临床用药，真正做到对症下药。本发明专利技术的特点是：１．简单，不需测序；便宜，一般分子生物学实验室或检验室就可操作；３．灵敏度高，可以检测到测序漏诊的病例。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域中的临床检测技术，具体涉及一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变的方法。利用该基因检测方法不仅能够快速检测肺癌病人肿瘤组织DNA某些区域中的点突变，更重要的是可以预测治疗非小细胞性肺癌新药——吉非替林(Gefitinib)对病人是否有疗效，指导临床用药，真正做到对症下药。
技术介绍
肺癌在中国是发病率最高的肿瘤，致病因素主要是吸烟。据医学统计有85％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸烟造成的。而其它可造成肺癌发病的因素还包括一些与工业致癌物的接触，如石棉、砷、铀、镍、铬酸盐等以及室内空气被氡气及福尔马林(甲醛)污染等。肺癌在组织学上分为4种类型鳞癌、腺癌、大细胞肺癌以及小细胞肺癌。这4种肺癌在临床上也可简单地归纳为非小细胞肺癌(前3种)和小细胞肺癌两种。从目前的医疗水平看，纯西医治疗效果总的来说，大约只有13％的肺癌病人(男性12％，女性16％)诊断后治疗存活5年及5年以上，而非小细胞肺癌病人的5年生存率大约为15％。据统计在肺癌病人中，大约有75％是非小细胞肺癌。根据现代生物医学研究成果，表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶，表皮生长因子(EGF)与表皮生长因子受体(EGFR)结合导致受体自身磷酸化并激活其激酶活性，通过一系列由磷酸化传导的信号传递，形成激活细胞生存和分化的机制。在多种癌症包括非小细胞肺癌中，表皮生长因子受体(EGFR)及其它一些蛋白激酶异常活化或过高表达是这种机制的典型特征。药物化疗法是目前治疗非小细胞肺癌的有效方法，但也只能延长病人的寿命，并不能根治，而且伴随着严重的副反应。吉非替林(Gefitinib)是美国食品和药品管理局(FDA)批准的治疗对其它化疗不敏感非小细胞肺癌病人的新药。它是一种小分子化合物，其作用是特异性地结合在表皮生长因子受体(EGFR)的ATP结合区，并阻断表皮生长因子受体(EFGR)的激酶活性。不过在临床治疗中，大多数非小细胞肺癌患者对吉非替林(Gefitinib)并不敏感。为此，哈佛医学院附属医院的两个研究小组通过研究，最近同时发现在几乎所有对吉非替林治疗有反应的病人的肿瘤组织中，表皮生长因子受体(EGFR)基因含有特定的基因突变。这些突变都发生在表皮生长因子受体(EGFR)的第18，19，21外显子里(第18外显子点突变；第19外显子一段碱基缺失性删除突变；第21外显子点突变L858R；第21外显子点突变L861Q)，对应于蛋白的激酶活性区，特别是ATP结合部位，病人一般含有一个或多个突变。而在其他没有反应的病人肿瘤组织中该基因里则没有这些突变。研究表明这些突变在腺癌组织中的发生率有21％，其它形式的非小细胞肺癌只有2％。而在日本，26％的非小细胞性肺癌病人中有此类突变，比美国病人突变率高。更为显著的是，日本女性腺癌病人中有50％具以上表皮生长因子受体(EGFR)突变。可以推测中国非小细胞肺癌病人中的突变率将与日本人相似。上述新发现可以改变吉非替林(Gefitinib)的使用方法，使该药品的使用更加科学有效，即检测该基因突变情况可以预测病人是否对肺癌新药吉非替林(Gefitinib)有反应。具体是利用基因检测的方法检测病人肿瘤组织DNA中这些区域中的突变可以预测吉非替林(Gefitinib)是否对病人有疗效，真正做到对症下药。聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛使用于基因检测的方法。利用PCR扩增上述表皮生长因子受体(EGFR)基因突变所在区片断，然后用测序可检查病人该基因是否有突变。但测序要分别测定表皮生长因子受体(EGFR)的第18，19，21三个外显子片段，这种测定需要进行三次，不仅费时，而且成本较高；另外，测序需要测序仪，这种仪器非常昂贵，一般单位无力配备。因此，这种方法在临床上难以推广应用。
技术实现思路
本专利技术目的是针对第18，21两个外显子片段，提供一种简便、快速的检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变的方法，以指导医生对非小细胞性肺癌病人的临床用药。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是一种，包括下列步骤(1)、准备DNA①、从人体肺部采集病变组织；②、从病变组织中获取DNA；(2)、对DNA进行扩增利用PCR扩增方法，采用下列三组对应外显子DNA片段的至少一组四引物进行扩增第18外显子点突变DNA片段的四引物为内源有义 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；内源反义 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有义 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反义 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外显子L858R点突变DNA片段的四引物为内源有义 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；内源反义 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外显子L861Q点突变DNA片段的四引物为内源有义 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；内源反义 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具体步骤为①、将上述每组四引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系；②、分别对各反应体系重复进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可观察即可；(3)、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；(4)、观测结果根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断对应外显子位置是否发生点突变以及突变类型，具体判断方法如下①、如果观察到某外显子泳带中出现三条DNA条带时，则判定有杂合子突变；②、如果观察到某外显子泳带中仅出现两条DNA条带时，则用较小条带的大小与下列对应组中特异性产物的理论值对比，根据接近程度来判断是纯合子突变或是正常特异性，三组特异性产物的理论值如下A、第18外显子点突变DNA片段的特异性产物理论值为 正常特异性产物大小198个碱基；突变特异性产物大小270个碱基；非特异性产物大小420个碱基；B、第21外显子L858R点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小118个碱基；突变特异性产物大小178个碱基；非特异性产物大小248个碱基；C、第21外显子L861Q点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小100个碱基；突变特异性产物大小192个碱基；非特异性产物大小248个碱基。上述技术方案中的有关内容解释如下1、关于特异性DNA片段的PCR扩增PCR(polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝待扩增的DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于基因检测。PCR扩增的基本原理是模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤：（１）、准备ＤＮＡ①、从人体肺部采集病变组织；②、从病变组织中获取ＤＮＡ； （２）、对ＤＮＡ进行扩增利用ＰＣＲ扩增方法 ，采用下列三组对应外显子ＤＮＡ片段的至少一组四引物进行扩增：第１８外显子点突变ＤＮＡ片段的四引物为：内源有义ＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＧＧ；内源反义ＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧ ＡＡＣＡ；外源有义ＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣ；外源反义ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡＧ；第２１外显子Ｌ８５８Ｒ点突变ＤＮＡ片段的四 引物为：内源有义ＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＡＣＴ；内源反义ＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣ；外源有义ＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＣＣ；外源 反义ＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＡＡＧＣＣ；第２１外显子Ｌ８６１Ｑ点突变ＤＮＡ片段的四引物为：内源有义ＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴ；内源反义ＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡ ＣＣＣＡＡＣＴ；外源有义ＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＣＣ；外源反义ＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＡＡＧＣＣ；具体步骤为：①、将上述每组四引物分别与获取的ＤＮＡ、４ 种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性ＤＮＡ聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系；②、分别对各反应体系重复进行ＰＣＲ循环，将ＤＮＡ量扩增至凝胶电泳可观察即可；（３）、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述ＤＮＡ扩增后的体系做凝 胶电泳；（４）、观测结果根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断对应外显子位置是否发生点突变以及突变类型，具体判断方法如下：①、如果观察到某外显子泳带中出现三条ＤＮＡ条带时，则判定有杂合子突变；②、 如果观察到某外显子泳带中仅出现两条ＤＮＡ条带时，则用较小条带的大小与下列对应组中特异性产物的理论值对比，根据接近程度来判断是纯...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王进，朱辉，秦正红，
申请(专利权)人：王进，朱辉，秦正红，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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