新表达载体制造技术

本发明专利技术揭示了用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体、通过该载体转化的哺乳动物细胞及该哺乳动物细胞的制造方法。该表达载体包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体，具体涉及包括基因表达调控位点、位于其下游的编码所需蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因的表达载体。
技术介绍
使用通过整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体转化的哺乳动物细胞来制造重组体蛋白质的方法是在医药品制造等工业领域中广泛普及的技术，0-半乳糖苷酶么、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、a -L-艾杜糖醛酸酶、酸性α -葡糖苷酶等溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子VI1、凝血因子珊、凝血因子IX等凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、各种抗体药物等使用该技术制造，作为医药品在市场上销售。这时，作为表达载体，一般采用在诱导强基因表达的基因调控位点、例如来源于巨细胞病毒(CMV)的启 动子、SV40初期启动子、延伸因子la (EF-1)启动子等的下游整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体。导入了这样的表达载体的哺乳动物细胞可表达整合至表达载体的所需蛋白质，其表达量根据各个细胞而不同，并不一致。因此，为了高效地生产重组体蛋白质，需要从导入了表达载体的哺乳动物细胞中筛选所需蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该筛选，表达载体整合有起到筛选标记物的作用的基因。作为筛选标记物，最一般的是分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(耐药性标记物)。哺乳动物细胞在一定浓度以上的上述药剂的存在下死亡。但是，导入了表达载体的哺乳动物细胞可通过整合至表达载体中的药剂筛选标记物分解上述药剂，将其无毒化或低毒化，所以在上述药剂的存在下也可生存。因此，如果在含有一定浓度的上述药剂的培养基中培养导入了表达载体的细胞，仅以高水平表达药剂筛选标记物的细胞增殖，结果筛选出那些细胞。以高水平表达药剂筛选标记物的细胞存在同时整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因也以高水平表达的倾向，所以结果获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。作为筛选标记物，还已知使用谷氨酰胺合成酶(GS)的表达载体(参照专利文献1、2)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。如果将哺乳动物细胞在作为谷氨酰胺合成酶的抑制剂的一定浓度的蛋氨酸磺酸盐(MSX)的存在下用谷氨酰胺缺陷培养基进行培养，则细胞死亡。但是，如果将作为筛选标记物整合了谷氨酰胺合成酶的表达载体导入哺乳动物细胞，则该细胞中谷氨酰胺合成酶的表达水平上升，所以在更高浓度的MSX的存在下也可增殖。这时，如果使MSX的浓度逐渐上升的同时继续培养，则可获得在更高浓度的MSX的存在下也可增殖的细胞。该现象被认为是因整合至哺乳动物细胞的基因组内的该表达载体在基因组内进行复制来增加拷贝数而引发。即，由于拷贝数增加，一个细胞中的基因组内存在的药剂筛选标记物的基因数增加，基因的表达量相对增加。这时，整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因的拷贝数也复制而增加，所以可获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。例如，专利文献I中记载，通过使用GS表达载体和蛋氨酸磺酸盐(MSX)，与使用DHFP (二氢叶酸还原酶)/MTX (甲氨蝶呤)的情况相比，可实现更高的拷贝数。此夕卜，专利文献2中记载，通过使用GS基因和MSX，宿主细胞的DNA中，随着GS基因的拷贝数的增加，也可以使与之不同的异型基因的拷贝数也增加，由此可增加所需多肽的生产水平。如上所述，含筛选标记物的表达载体适合于效率良好的重组体蛋白质的制造，得到广泛应用。表达载体上，编码所需蛋白质的基因和编码筛选标记物的基因一般分别整合至不同的基因调控位点下(参照专利文献3)。但是，还已知一个基因调控位点下串联整合编码所需蛋白质和筛选标记物的基因使其表达的方法(参照专利文献4、5、6、7)，这时在编码所需蛋白质和筛选标记物的基因之间插入有内部核糖体进入位点(IRES:1nternalribosome entry site)等，由此可由一个基因调控位点表达2个基因。内部核糖体进入位点已知有多种，有来源于例如微小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的位点(参照专利文献8、9、10)。作为应用内部核糖体进入位点的表达载体，已知在内部核糖体进入位点的下游作为筛选标记物整合有单纯疱疹病毒胸苷激酶的表达载体(参照专利文献11)、使用2个以上的内部核糖体进入位点结合有3种以上的基因的表达载体(参照专利文献12)。如上所述，通过各种表达载体的开发，使用哺乳动物细胞制造重组体蛋白质的方法在红细胞生成素等医药品的制造中得到实用化，为了降低其制造成本，始终要求效率更高的表达载体的开发。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特表昭63-502955号公报专利文献2:日本专 利特表平5 - 504050号公报专利文献3:日本专利特开2009-273427号公报专利文献4:日本专利特开昭59-173096号公报专利文献5:日本专利特开昭60-199387号公报专利文献6:日本专利特表平4 - 500004号公报专利文献7:日本专利特开平8-256776号公报专利文献8:日本专利特表平6 - 509713号公报专利文献9:日本专利特表平8 - 502644号公报专利文献10:日本专利特开平10-327871号公报专利文献11:日本专利特表2008-539785号公报专利文献12:日本专利特表2004-520016号公报专利技术的概要专利技术所要解决的技术问题本专利技术的目的在于提供用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体、通过该载体转化的哺乳动物细胞及该哺乳动物细胞的制造方法。解决技术问题所采用的技术方案为了上述目的的研究中，本专利技术人发现通过使用整合有基因表达调控位点以及位于其下游的编码人葡糖脑苷脂酶等所需蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因的表达载体使哺乳动物细胞转化，可使编码该蛋白质的基因以高水平表达，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供以下的专利技术。表达载体，它是用于使蛋白质表达的表达载体，其中，包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。如上述的表达载体，其中，该基因表达调控位点选自来源于巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、延伸因子I启动子。如上述或的表达载体，其中，该内部核糖体进入位点来源于选自微小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus)、柯萨奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蚬触角足(Antennapedia)基因、果蚬超双胸(Ultrabithorax)基因的病毒或基因的5’非翻译区。如上述或的表达载体，其中，该内部核糖体进入位点来源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻译区。如上述或的表达载体，其中，该内部核糖体进入位点来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区。如上述 中的任一项的表达载体，其中，该内部核糖体进入位点是在野生型的内部核糖体进入位点的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高桥健一，
申请(专利权)人：日本化学研究株式会社，
类型：
国别省市：