包含微小RNA识别元件的CMV载体制造技术

本发明专利技术公开了包含异源抗原和微小RNA识别元件的重组CMV载体，以在源自髓样细胞的微小RNA，活性UL128蛋白和活性UL130蛋白存在下沉默CMV基因的表达。本发明专利技术还公开了包含异源抗原和微小RNA识别元件的重组CMV载体，以在源自髓样细胞的微小RNA，无活性UL128蛋白和无活性UL130蛋白存在下沉默CMV基因的表达。本发明专利技术还公开了使用这些载体产生非常规免疫应答的方法。这种免疫应答的特征在于产生主要受MHC‑II限制的CD8+T细胞应答。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含微小RNA识别元件的CMV载体相关申请的交叉引用本申请基于并且要求于2015年11月20日提交的名称为CMVVECTORSCOMPRISINGMICRORNARECOGNITIONELEMENTS的美国临时申请第62/258,393号，以及于2016年7月21日提交的名称为CMVVECTORSCOMPRISINGMICRORNARECOGNITIONELEMENTS的美国临时申请第62/365,259号的优先权，以上临时申请的公开内容通过引用整体并入本专利技术。
本专利技术实施方式涉及CMV载体在免疫中的用途，更具体地，涉及用异源抗原免疫后引发非常规免疫应答的改良CMV载体形式的生成。感谢政府支持本专利技术是在美国政府的支持下根据美国国立卫生研究院授予的资助号P01AI094417的条款创建的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
表达猿猴免疫缺陷病毒蛋白的恒河猴巨细胞病毒疫苗(RhCMV/SIV)提供对致病SIV的保护(HansenSG等，NatMed15,293(2009)；HansenSG等，Nat473,523(2011)；这两篇文献均通过引用并入本专利技术)。这种保护与其他T细胞疫苗根本不同之处在于其非常有效并且几乎瞬时发作，约50％的疫苗在病毒血症严重钝化和收缩急性期后表现出对病毒复制的完全控制。尽管受RhCMV保护的猕猴呈现周期性低水平的病毒血症“脉冲”，但没有观察到CD4+记忆T细胞耗竭，没有出现SIV特异性抗体应答，随后，随着时间的推移，病毒核酸变得几乎无法量化而有复制能力的病毒从受保护动物的组织中消失。这些事件在自发SIV优良对照和DNA初始/Ad5加强接种的对照中并未发生(HansenSG等，Nature502,100(2013)；其通过引用并入本专利技术)。考虑到在RhCMV/SIV接种的猕猴中RhCMV诱导的CD8+T细胞在介导这种保护作用中的核心作用，界定这些T细胞的功能特性对理解它们对RhCMV/SIV载体诱导控制SIV复制的机理贡献至关重要。理解这些特性可能反过来导致表达异源抗原的巨细胞病毒疫苗载体的新用途。CMV可在髓系细胞中潜伏并重新激活，并且巨噬细胞在病毒传播中起核心作用。此外，树突状细胞是必需的体内抗原呈递细胞。表达异源抗原的CMV载体特异性地构建为它们不能在这些细胞中复制，可以用作引发改良的非常规免疫谱的新疫苗候选物。
技术实现思路
本专利技术公开了巨细胞病毒(CMV)载体，其包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列；和包含微小RNA识别元件(MRE)的第二核酸序列，所述第二核酸序列在由髓系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达。微小RNA识别元件可操作地连接到CMV基因上，该CMV基因是体内CMV生长所必需的或促进体内CMV生长。所述载体还包括编码活性UL128蛋白(或其直系同源物)的核酸序列和编码活性UL130蛋白(或其直系同源物)的核酸序列。在一些实施方式中，所述载体将缺乏活性UL128蛋白和活性UL130蛋白。本专利技术还公开了在受试者中对至少一种异源抗原产生免疫应答的方法。该方法包括以有效引起对异源抗原的CD8+T细胞应答的量向受试者施用本专利技术公开类型的CMV载体。该免疫应答的特征在于至少10％的CD8+T细胞受II类MHC限制，少于10％的细胞受MHC-E限制。附图说明通过以下结合附图的详细描述将容易理解实施方式。在附图中通过示例而非限制的方式示出了实施方式。图1是显示根据各种实施方式，使用M-CSF或M-CSF条件培养基分化的来自恒河猴的CD14+PBMC中miR-142-3p表达的条形图；图2是显示根据各种实施方式，分离自恒河猴的指定细胞类型和组织中miR-142-3p表达的条形图；图3A、3B、3C和3D共同显示了根据各种实施方式通过galK重组产生的重组RhCMV68-1RTNRh156/Rh108miR-1423p突变病毒的分析；图3A是显示根据各种实施方式，使用位于插入位点侧翼的引物的PCR证明galK表达盒的插入及用miR-1423p靶位点替换galK表达盒的结果的凝胶图像；；图3B是显示根据各种实施例，BACDNA的XmaI消化的凝胶图像，显示保持完整的基因组；图3C是显示BAC基因组DNA被分离并电穿孔进入恒河猴成纤维细胞的凝胶图像。在三次传代中的每一代将病毒进行噬斑纯化，分离病毒DNA并通过PCR分析miR-1423p靶位点插入的保持。此外，根据各种实施方式，对这些PCR产物进行测序，并未检测到突变；图3D是根据各种实施方式的显示来自构建体的gag和HA表达的凝胶图像；图4是一组两幅图，每个图显示使用68-1RTNRh156/Rh108miR-1423p病毒的多步增长曲线。用阴性对照miRNA或miR-1423pRNA模拟物转染端粒酶处理的(Telomerized)恒河猴成纤维细胞。转染后24小时，以0.01的MOI用WT或68-1RTNRh156/Rh108miR-1423p病毒感染细胞。根据各种实施方式，在指定的时间收获细胞和上清液并在恒河猴成纤维细胞上滴定；图5是使用磁性细胞分选从恒河猴PBMC中分离的CD14+细胞的条形图。在M-CSF条件培养基存在下培养细胞7天以允许其分化成巨噬细胞。以10的MOI用WT68-1RTN或68-1RTNRh156/Rh108miR-1423p病毒感染细胞。根据各种实施方式，在指定的时间点收获病毒DNA并通过qPCR分析Rh87DNA水平；图6是一组两幅图，显示根据各种实施方式，外周T细胞对用RhCMV-68-1-Rh156,108miR-142-SIVrtn感染的动物中的SIVRTN抗原的应答；图7是根据各种实施方式，在用68-1.2RhCMV-Rh156,108miR142/SIVgag感染的动物中的CD8+T细胞应答的一组三幅图；图8是根据各种实施方式，用指定载体感染的指定基因型动物的表位MHC限制性图谱；图9是一组两幅图，显示使用68-1.2RTNRh156/Rh108miR-1423p病毒的生长曲线。根据各种实施方式，另外如图4所述进行该过程；图10是根据各种实施方式，通过galK重组产生RhCMVRh156/Rh108miR-1423p突变病毒的示意图。图11A，11B和11C共同显示根据各种实施方式的通过galK重组产生的重组RhCMV68-1.2GAGRh156/Rh108miR-1423p突变病毒的分析；图11A是凝胶图像，其显示使用位于插入位点侧翼的引物的PCR证明galK表达盒的插入及用miR-1423p靶位点替换galK表达盒的结果。另外，分离BAC基因组DNA并电穿孔进入恒河猴成纤维细胞。在三次传代(P1，P2和P3)的每一代中分别噬斑纯化病毒并分离病毒DNA，并通过PCR分析miR-1423p靶位点插入的保持。根据各种实施方式，对这些PCR产物进行测序并未检测到突变；图11B是显示根据各种实施方式的RhCMV68-1.2GAGRh156/Rh108miR-1423pBACDNA的XmaI消化的凝胶图像，其表明保持完整基因组；图11C是显示根据各种实施方式，在恒河猴成纤维细胞中RhCMV68-1.2GAGRh156/Rh108miR-1423p在整个3代传代中GAG表达的凝胶图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巨细胞病毒(CMV)载体，其包含：(a)编码至少一种异源抗原的第一核酸序列；(b)第二核酸序列，其包含与CMV基因能操作地连接的第一微小RNA识别元件(MRE)，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强的，并且其中在由髓系细胞表达的微小RNA存在下所述MRE沉默表达；(c)编码活性UL128蛋白或其直系同源物的第三核酸序列；和(d)编码活性UL130蛋白或其直系同源物的第四核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.20 US 62/258,393;2016.07.21 US 62/365,2591.一种巨细胞病毒(CMV)载体，其包含：(a)编码至少一种异源抗原的第一核酸序列；(b)第二核酸序列，其包含与CMV基因能操作地连接的第一微小RNA识别元件(MRE)，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强的，并且其中在由髓系细胞表达的微小RNA存在下所述MRE沉默表达；(c)编码活性UL128蛋白或其直系同源物的第三核酸序列；和(d)编码活性UL130蛋白或其直系同源物的第四核酸序列。2.如权利要求1所述的CMV载体，其中在miR-142-3p、miR-223，miR-27a、miR-652、miR-155、miR146a、miR-132、miR-21或miR-125中的一种或一种以上存在下，所述第一MRE沉默。3.如权利要求1或2所述的CMV载体，其中所述至少一种异源抗原包含病原体特异性抗原、肿瘤抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。4.如权利要求3所述的CMV载体，其中所述宿主自身抗原是源自T细胞受体(TCR)的可变区的抗原或源自B细胞受体的可变区的抗原。5.如权利要求3所述的CMV载体，其中所述病原体特异性抗原衍生自选自以下的病原体：人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫寄生虫和结核分枝杆菌。6.如权利要求3所述的CMV载体，其中所述肿瘤抗原与选自以下的癌症有关：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌(RCC)和生殖细胞肿瘤。7.如权利要求1-6中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL82(pp71)蛋白、US11或其直系同源物。8.如权利要求1-7中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL79蛋白或其直系同源物。9.如权利要求1-8中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性US11蛋白或其直系同源物。10.如权利要求1-6中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL82(pp71)蛋白或活性UL79蛋白、或其直系同源物。11.如权利要求1-6中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL82(pp71)蛋白或活性US11蛋白、或其直系同源物。12.如权利要求1-6中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL79蛋白或活性US11蛋白质、或其直系同源物。13.如权利要求1-6中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体不表达活性UL79蛋白、活性UL82(pp71)蛋白、或活性US11蛋白、或其直系同源物。14.如权利要求1-13中任一项所述的CMV载体，其中所述CMV载体是人CMV(HCMV)载体或恒河猴CMV(RhCMV)载体。15.一种在受试者中产生针对至少一种异源抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-14中任一项所述的CMV载体以在所述受试者中引发针对所述至少一种异源抗原的CD8+T细胞应答。16.如权利要求15所述的方法，其中由所述CMV载体引发的所述CD8+T细胞中的至少10％受II类MHC或其直系同源物限制。17.如权利要求16所述的方法，其中所述CD8+T细胞中的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受II类MHC或其直系同源物限制。18.如权利要求17所述的方法，其中少于10％的所述CD8+T细胞受MHC-E或其直系同源物限制。19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经暴露于CMV。20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类或非人灵长类动物。21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中施用所述CMV载体包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内或口服施用所述CMV载...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰伊·内尔松，斯科特·汉森，米根·H·汉考克，路易斯·皮克尔，克劳斯·弗鲁赫，
申请(专利权)人：俄勒冈健康与科学大学，
类型：发明
国别省市：美国,US