一种含有重组腺病毒的制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种含有重组腺病毒的制剂，所述制剂由重组腺病毒、缓冲液或缓冲体系和保护剂组成，其中，所述的缓冲液或缓冲体系选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种；所述的保护剂选自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亚砜。本发明专利技术制剂具有组分简单，不含有二价阳离子盐和非离子表面活性剂，如MgCl2和吐温-80等，却能在2～8℃甚至室温很好保存腺病毒，并使其具有良好的稳定性等突出优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组腺病毒，尤其涉及一种含有重组腺病毒的制剂。
技术介绍
根据国家食品药品监督管理局发布的《关于发布化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求的通知》(国食药监注20087号)中规定辅料选用的基本原则:在满足需要的前提下，注射剂所用辅料的种类及用量应尽可能少。重组腺病毒作为临床药物，在能维持其稳定性的前提下，原则上要求制剂辅料种类和用量越少越好。已报道的现有技术中，美国专利US2006/0205080A1公开了一种包含Tris_HCl、MgCl2、甘氨酸和选自丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氢呋喃、乙二醇醚的含水共溶剂的组合物，该制剂可在2 8°C较好地保持腺病毒的活性，但该组合物中的组分较多，导致产品生产较为复杂，甚至加大基因治疗药物的安全性风险。此外，中国专利C N101163794A公开了一种腺病毒组合物，该组合物包含腺病毒颗粒及能维持pH在8.0-9.6的缓冲液和甘油，具有组分简单的优点，但其在2 8°C条件下长期保存腺病毒的稳定性不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有重组腺病毒的制剂，该制剂由包括重组腺病毒、缓冲液或缓冲体系、阻止腺病毒发生物理或化学变化而失活的保护剂组成，所述的缓冲液或缓冲体系选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种或其组合；适合于本专利技术的保护剂选自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亚砜的任一种或其组合。进一步，所述的缓冲液或缓冲体系的pH为7.4-8.6。进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为精氨酸-盐酸缓冲液。进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为Tris-HCl缓冲液。进一步，所述的缓冲液或缓冲体系为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。进一步，所述的多羟基化合物为丙二醇，进一步，本专利技术制剂中丙二醇的浓度为5-20w/v%，优选为 10-20w/v%。本专利技术可根据稳定维持腺病毒活性的需要，调整和选择所需的缓冲液浓度。本专利技术制剂中缓冲液的浓度为lO-lOOmM，所述缓冲液选自TriS-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种。这样的选择可以取得令人满意的保存结果。本专利技术的制剂由重组腺病毒、10_50mM缓冲液和10%丙二醇的组成，pH为7.8 ;所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸的任一种。本专利技术的磷酸氢二钠-柠檬酸和精氨酸-盐酸缓冲液不仅具有很好的缓冲作用，还对腺病毒具有一定程度的保护作用。本专利技术的制剂具有组分简单，不含有二价阳离子盐和非离子表面活性剂，如MgCl2和吐温-80等，也能在2 8°C甚至室温很好保存腺病毒，并使其具有良好的稳定性等突出优点。本专利技术制剂主要应用于保存基因治疗的重组腺病毒，还可应用于保存任何野生型腺病毒或其他用途的重组腺病毒。具体地说，包括所有利用重组DNA技术构建的复制缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或动物的野生型腺病毒或其突变腺病毒。采用国际通用的TCID50法检定的病毒滴度值和紫外法检定的病毒颗粒数之比值(即比活度)来评价本专利技术的重组腺病毒的稳定性。本专利技术采用TCID50方法测定重组腺病毒滴度，其原理是:将经过系列稀释的病毒样品感染293细胞，将每个稀释度所感染一定数量的细胞孔培养10天，在显微镜下观察各细胞孔中的细胞状况，统计病变细胞孔，利用TCID50计算公式，计算病毒滴度。TCID50/ml=10+卜d(sKl.5)]+b其中，L:为最低稀释度的对数；d:为稀释对数之间的差；s:为病变阳性孔比率之和；b:为病毒接种量，换算为每晕升体积的倍数的对数。本专利技术采用分光光度法检测腺病毒的颗粒数，其原理是:理论上，野生型5型腺病毒的成分是87%蛋白质和13%DNA。因此，腺病毒颗粒的浓度可直接用紫外分光光度计测量。蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基在277nm处有紫外吸收，而双链线性DNA在260nm有最大吸收值。本法采用含有0.1%SDS (十二烷基硫酸钠)的制剂缓冲液，将病毒衣壳分解成蛋白质和DNA，再利用双链线性DNA在260nm处具有最大吸收值，在有去垢剂时，颗粒浓度与260nm吸光值成比例，用分光光度计于260nm处测定供试品的吸光度值，采用公式(IAU=L I X 1012VP/mL)计算病毒颗粒数。测试病毒颗粒数的适用范围为供试品病毒颗粒数彡 2X10nVP/mL。本专利技术重组腺病毒稳定性的最终的判断指标为，根据检测所得病毒滴度和颗粒数计算所得的病毒比活度，即病毒比活度=病毒滴度/病毒颗粒数X100%。国家药品食品监督管理局(SFDA)在《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原贝丨J》中规定，临床重组腺病毒比活度应高于3.3% ;张晓志等(《中华医学杂志》，2004年，第84卷第10期)，在“重组腺病毒临床级基因治疗制品的质量控制”中提到，评价腺病毒制剂的稳定性时，制剂中腺病毒的比活度应该大于3.3%。”除非另有说明，本专利技术所述百分含量均为重量体积百分含量。本专利技术的重组腺病毒的制备方法可以采用本领域通常的重组腺病毒制备方法所得，一般来说包括细胞复苏、种子细胞制备、病毒感染、扩增、细胞裂解、澄清过滤、浓缩换液、原液制备等过程本专利技术的重组腺病毒制剂的制备方法可以采用本领域通常制备重组腺病毒的方法，一般来说包括如下步骤:将原液进行换液、检测浓度、用配比好浓度的制剂辅料进行稀释、除菌、分装得到成品。本专利技术的另一目的在于提供重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的重组腺病毒制剂具有下述优点:本专利技术的重组腺病毒制剂不仅可以很好保存重组腺病毒的活性，有效地防止腺病毒的聚集或分裂，而且组分简单，不含有二价阳离子盐，如MgCl2，利于重组腺病毒的生产和临床使用。因而，本专利技术的重 组腺病毒制剂不仅可以良好保存重组腺病毒及其其他腺病毒，还具有易于生产控制和产业化，制造成本低，制剂安全性更高更好等优点。本专利技术的制剂在重组腺病毒的保存上具有突出的优势。具体实施例方式以下将结合实施例具体说明本专利技术，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并不是对本专利技术的进一步限制。实施例1 pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响为了研究pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，在25°C条件下，我们研究了ρΗ6.8 8.6范围内，pH值分别为6.8,7.2,7.4,7.6,7.8,8.2,8.6时，pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。专利技术人通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了 pH值对重组腺病毒稳定性的影响，结果见表I。表I pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有重组腺病毒的制剂，所述制剂由重组腺病毒、缓冲液和聚乙二醇?400组成，其中，所述的缓冲液选自Tris?HCl缓冲液、磷酸氢二钠?柠檬酸缓冲液、精氨酸?盐酸缓冲液的任一种或其组合。

【技术特征摘要】
1.一种含有重组腺病毒的制剂，所述制剂由重组腺病毒、缓冲液和聚乙二醇-400组成，其中，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、精氨酸-盐酸缓冲液的任一种或其组合。2.根据权利要求1所述的制剂，所述缓冲液的pH为7.4-8.6。3.根据权利要求1所述的制剂，所述制剂中聚乙二醇-400的浓度为5-20w/v%。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳艳，付竞峰，
申请(专利权)人：成都康弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：